鹅副粘病毒F基因的克隆、分析及核酸探针检测方法的建立

论文摘要

鹅副粘病毒病（Goose Paramyxo Virus Disease）是由鹅副粘病毒（Goose Paramyxo Virus）引起的一种急性、高度接触性传染病。该病以肠道糠麸样溃疡,胰腺、脾脏肿胀且表面有大小不等的灰白色坏死灶为主要特征。鹅副粘病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）,副粘病毒亚科,腮腺炎病毒属（Rubulavirus）的病毒。由于该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成了严重威胁,所以被世界卫生组织（OIE）列为A类烈性传染病。长期以来,我国普遍采用接种疫苗为主的鹅副粘病毒病综合防制措施,使的该病得以控制,但近年来,该病的流行又呈现出新的特点:高抗体禽群发生该病,禽1型副粘病毒对水禽的致病力逐渐增强,水禽（鹅、鸭、企鹅等）不仅是禽1型副粘病毒的宿主和储存库,而且成为禽1型副粘病毒的易感禽类。其中鹅的易感性最高,且不同日龄的鹅均易感,日龄越小,发病率和死亡率越高,半个月内的雏鹅发病率和死亡率最高,高达100%。近年来,该病在我国呈上升趋势,给我国养鹅业乃至整个养禽业带来巨大的经济损失。在对2005年从山东省梁山县某鹅场分离的一株鹅副粘病毒野毒株（暂名为LS-1株）进行生物学特性研究的基础上,扩增其F基因,并与传统疫苗株、标准强毒株F48E9和已发表的江苏分离株进行同源性比较、进化树分析,旨在从分子生物学水平阐明梁山地区与其它地区流行株之间的亲缘关系,为该病的预防和控制提供理论依据。本课题分为三部分进行研究。第一部分:鹅副粘病毒LS-1株的分离鉴定及生物学特性研究该研究从梁山县一例以肠道糠麸样溃疡,胰腺、脾脏肿胀且表面有大小不等的灰白色坏死灶为主要特征的病死鹅中分离到一株病毒,血凝试验和血凝抑制试验表明该分离株具有血凝性,且其血凝特性能被新城疫病毒标准阳性血清抑制,而不被H9N2亚型禽流感病毒标准阳性血清所抑制。毒力测定结果表明该病毒鸡肧平均致死亡时间（MDT）为39.5h;1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数为1.76;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）为2.42。动物回归实验结果表明攻毒鹅表现典型的临床症状和病理变化。第二部分:鹅副粘病毒LS-1株F基因的克隆与序列分析根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒F基因序列设计合成两对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出鹅副粘病毒LS-1株F基因全序列,与pMD-18T载体连接后进行序列测定、分析。结果表明:鹅副粘病毒LS-1株F基因核苷酸长度为1653bp,编码551个氨基酸,有6个糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-117,与已发表的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符,从分子水平上表明鹅副粘病毒山东分离株（LS-1）为一强毒株。该毒株F基因与目前已发表的鹅副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.098.4%之间,推导的氨基酸序列同源性在87.0%～98.5%之间;与传统疫苗株LaSota、强毒株F48E9的核苷酸和氨基酸同源性均分别为84.3%和86.8%。第三部分:鹅副粘病毒核酸探针检测方法的建立与应用根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒F基因序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR扩增出一条与目的片断大小一致,约856bp的基因片段,回收并纯化此PCR产物。用随机引物法合成cDNA,用地高辛标记,建立鹅副粘病毒核酸探针检测方法。该探针能与鹅副粘病毒核酸发生特异性杂交,而与H9N2亚型禽流感病毒、鹅细小病毒、大肠杆菌等核酸杂交均为阴性,且最低检出限量为3pg/μL。疑似病例检测结果表明,气管、肺脏、脾脏、肝脏均可检测出鹅副粘病毒,其中以气管的检出率最高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 鹅副粘病毒概述
• 1.1 流行病学
• 1.2 临床症状及病理变化
• 1.3 病毒的组织嗜性
• 2 病原学研究
• 3 分子生物学研究
• 3.1 融合蛋白
• 3.2 HN 蛋白
• 3.3 M 蛋白
• 3.4 NP 蛋白
• 3.5 P 蛋白
• 3.6 L 蛋白
• 4 鹅副粘病毒检测方法的研究
• 4.1 病毒的分离与鉴定
• 4.2 血凝、血凝抑制试验
• 4.3 荧光抗体技术
• 4.4 酶联免疫吸附试验
• 4.5 RT-PCR 技术
• 4.6 单克隆抗体标记技术
• 4.7 核酸探针检测技术
• 5 鹅副粘病毒病的预防与控制
• 5.1 活疫苗
• 5.2 灭活苗
• 5.3 亚单位疫苗
• 5.4 核酸疫苗
• 5.5 重组活载体疫苗
• 6 研究的目的与意义
• 试验一 鹅副粘病毒的分离鉴定及生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒与细菌
• 1.1.2 试验用SPF 鸡胚
• 1.1.3 试验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒的分离与增值
• 1.2.2 血凝、血凝抑制试验
• 1.2.3 理化特性测定
• 1.2.4 病毒血凝特性测定
• 1.2.5 鸡胚平均致死亡时间（MDT）的测定
• 1.2.6 1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定
• 1.2.7 6周龄雏鸡静脉接种致病指数（IVPI）的测定
• 1.2.8 动物致病性试验
• 2 结果
• 2.1 血凝试验和血凝抑制试验
• 2.2 理化特性的测定
• 2.3 血凝特性的测定
• 2.4 MDT的测定
• 2.5 ICPI测定结果
• 2.6 IVPI测定结果
• 2.7 动物致病性试验结果
• 3 讨论
• 实验二 鹅副粘病毒LS-1 株F 基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 载体与受体菌
• 1.1.3 仪器和试剂
• 1.1.4 RT-PCR 引物
• 1.1.5 SPF 鸡胚
• 1.1.6 主要溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒的增殖与浓缩
• 1.2.2 病毒基因组RNA 的提取
• 1.2.3 cDNA 的合成
• 1.2.4 PCR 扩增
• 1.2.5 PCR 产物的克隆及序列分析
• 1.2.5.1 PCR 产物的回收与纯化
• 1.2.5.2 PCR 产物的连接
• 1.2.5.3 大肠杆菌 BL21 感受态细胞的制备
• 1.2.5.4 连接产物的转化
• 1.2.5.5 质粒 DNA 的提取
• 1.2.5.6 质粒DNA 的 PCR 鉴定
• 1.2.5.7 阳性质粒的酶切鉴定
• 1.2.5.8 重组质粒的序列测定及分析
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定结果
• 2.3 测序结果及序列分析
• 2.4 同源性分析
• 2.5 进化树分析结果
• 3 讨论
• 实验三 鹅副粘病毒地高辛标记探针检测方法的建立和应用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器和试剂
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 细菌和病毒
• 1.1.4 PCR 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 鹅副粘病毒F 基因扩增
• 1.2.2 探针的标记
• 1.2.3 核酸样品处理
• 1.2.4 杂交检测程序
• 1.2.5 探针标记效率检测
• 1.2.6 探针敏感性检测
• 1.2.7 探针特异性检测
• 1.2.8 最佳反应时间的选择
• 1.2.9 探针重复性和稳定性检测
• 1.2.10 标记探针和 RT-PCR 对已知鹅副粘病毒核酸的检测
• 1.2.11 标记探针对鹅副粘病毒疑似病例的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 RT-PCR 结果
• 2.2 RT-PCR 产物的克隆和序列测定
• 2.3 探针标记效率检测
• 2.4 特异性试验
• 2.5 敏感性实验
• 2.6 最佳杂交时间的选择
• 2.7 重复性和稳定性检测
• 2.8 两种检测方法对已知样品的检测
• 2.9 标记探针对鹅副粘病毒疑似病例的检测
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况