论文摘要
本研究以本课题组构建的植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NPm-8为出发菌株,对植酸酶基因phyA基因进行PCR介导的定点突变,在不改变所编码氨基酸的情况下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因第72位、146位、159位和165位编码精氨酸的两种密码子CGA、CGC进行定点突变,将4个位点的密码子突变成精氨酸高频使用的AGA,构建了突变基因phyAm-4的克隆载体pUC18-phyAm-4和酵母表达载体pPIC9k-phyAm-4,电击转化毕赤酵母,筛选获得了植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-NPm-4-2。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NPm-4-2酶活性测定结果表明,在BMGY/BMMY培养基中诱导36h后酶活力可达133800 u/ml,比出发菌株PP-NPm-8的63667u/ml提高了1.10倍,在麦芽汁培养基中,诱导36h后酶活力达136900u/ml,比PP-NPm-8的47600u/ml提高了1.87倍。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NPm-4-2表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为70.15KD。Southern blotting结果表明,phyA基因整合到酵母染色体DNA中。连续传10次培养实验证实,植酸酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定。 本研究提高了植酸酶在毕赤酵母中的表达量,为基因工程菌的产业化生产奠定了基础。
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