论文摘要
木聚糖广泛存在于植物细胞壁中,是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源。木聚糖的来源不同,分枝程度不同,其主链和支链带有的基团也不同。由于木聚糖结构的复杂性,它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。木聚糖酶（β-1,4-xylanase,EC 3.2.1.18）能够以内切方式作用于木聚糖分子中的β-1,4糖苷键产生不同长度的木寡糖和少量的木糖,因此是木聚糖降解酶中最关键的酶。本文以1株木聚糖酶产生菌黑曲霉（Aspergillus niger）F19为实验菌株,系统地研究了黑曲霉木聚糖酶基因xynA与xynB的克隆以及在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达、重组木聚糖酶XynB的纯化及其酶学性质研究,并进行了木聚糖酶XynB的热稳定性改造,得到了SS2、ST5、SST7共3个突变体,主要结论如下:1.xynA与xynB的克隆以及在大肠杆菌中的表达以黑曲霉（A.niger）F19的基因组DNA为模板,根据GenBank报道的黑曲霉xynA与xynB的全序列设计两对引物,PCR扩增得到木聚糖酶基因xynA和xvnB。将不带原基因信号肽编码序列的xynA和xynB以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌（Ecoli）表达载体pET-28a（+）上,并转化E.coli BL21,获得重组工程菌BLX1和BLX2。经过IPTG诱导,XynA和XynB都获得特异性表达,XynA以包涵体和胞内可溶性蛋白2种形式存在,而XynB表达的蛋白全部以胞内可溶性蛋白形式存在。2.木聚糖酶XynB的纯化木聚糖酶XynB重组表达蛋白以胞内可溶性蛋白的形式存在,且木聚糖酶基因xynB是和pET-28a（+）融合表达,木聚糖酶XynB的羧基端带有6×His蛋白表达标签,所以我们用Ni-NTA亲和层析柱对木聚糖酶XynB进行了纯化,并使其纯度达到了电泳纯水平,在SDS-PAGE上呈现出清晰的单一条带。3.木聚糖酶XynB的酶学性质分析利用纯酶分析XynB的酶学性质,木聚糖酶XynB的比活达到13500±128.4IU/mg,其Km和Vmax分别为12.5±0.08 mg/mL,289±10.8μmol/min/mg。它的最适反应pH为5.0,在pH 4.0～7.0之间保持最高活力的75%以上。该重组酶表现出很高的pH稳定性,在pH 3.0～8.0内常温环境下放置6 h,残余酶活保持在68%以上。XynB的最适反应温度为50℃,反应温度小于30℃或大于60℃的情况下重组木聚糖酶表现出较低的活性。该酶热稳定较差,在40℃以下较为稳定,60℃以上重组酶活性下降很快,60℃条件保温30 min后残余酶活为20%。在10 mmol/L浓度下不同金属离子对酶活力的影响研究表明,Zn2+、Co2+离子对重组酶有激活作用,分别使重组酶活性提高了8%和15%,Mn2+使重组酶的相对活性降低了21%,体现出对该酶活性一定的抑制作用,其他金属离子对重组酶活性的影响不大。4.木聚糖酶XynB的热稳定性改造由于XynB的比活较高,但是其热稳定性较差,这在一定程度上限制了木聚糖酶XynB在工业水平上的推广应用。为了提高XynB的热稳定性,我们采用了两种定点诱变的策略:一种是将木聚糖酶表面的Ser/Thr替换为Arg,提高XynB表面蛋白的正电荷数及其电解常数以提高蛋白的热稳定性;另外一种是在木聚糖酶的非催化区域引入二硫键,使其结构更加紧密从而提高其热稳定性。将正确的突变体SS2、ST5、SST7基因xynB’构建到表达载体pET-28a（+）上,并转化BL21表达突变蛋白,但是表达的蛋白大部分形成了包涵体,而且菌体破碎液离心后的上清液没有检测出木聚糖酶活性。目前,实验室正在构建XynB野生型和突变型的高效分泌型酵母表达系统以确定定点突变对该重组酶的热稳定性影响,为该酶的大规模工业应用提供基础资料。