α-半乳糖苷酶基因及酸性磷酸酶基因的克隆与表达研究

论文摘要

α-半乳糖苷酶（alpha-galactosidase，EC 3.2.1.22）是催化α-半乳糖苷键水解的酶类，广泛的分布于植物、动物和微生物体内。它不但可以催化α-半乳糖苷类的寡糖，还可以催化含α-半乳糖苷键的多聚糖。该酶在饲料、食品、造纸和医药工业等领域具有广泛的应用前景。然而目前α-半乳糖苷酶主要是从原始菌株中分离得到，产量较低，成本较高，利用微生物学和分子生物学的原理和手段，克隆α-半乳糖苷酶基因，构建高效表达和分泌的基因工程菌株来提高α-半乳糖苷酶产量，降低生产成本是解决这一问题的有效途径。从我国长江中下游的地热煤矿中分离得到一株属于地热芽孢杆菌的新菌株。根据同属的全基因组序列分析，从中克隆了推定的α-半乳糖苷酶基因a-gal-g。该基因全长2190bp，编码729个氨基酸，理论分子量为83.5 kD，理论等电点为6.595。将a-gal-g基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中，电击转化宿主菌GS115，从100个转化子中筛选到了13株表达α-半乳糖苷酶的重组子，其中92#转化子在3L发酵罐水平α-半乳糖苷酶的酶活力达80 U／ml以上。从高温塘泥（温度在40～85℃之间）中分离到一组嗜热微生物，提取环境基因组DNA，通过随机测序，发现许多基因与Thermus属的DNA相似性很高，根据GenBank上Thermus thermophilus HB8基因组序列中推定的酸性磷酸酶基因（TTHA1616），设计引物，PCR扩增得到一段798 bp的DNA序列，测序结果与Thermus thermophilus HB8基因组中酸性磷酸酶基因相似性达98％，含有完整的酸性磷酸酶保守区，于是将该基因在大肠杆菌中表达，得到一条约33kD的特异蛋白条带，酶活检测初步证实该推定蛋白具有酸性磷酸酶活力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 α-半乳糖苷酶的概念
• 1.1.1 α-半乳糖苷酶的来源
• 1.1.2 α-半乳糖苷酶的生理意义
• 1.1.3 α-半乳糖苷酶的酶学性质
• 1.1.4 α-半乳糖苷酶的分类
• 1.2 α-半乳糖苷酶的应用领域与研究进展
• 1.2.1 α-半乳糖苷酶的应用领域
• 1.2.2 α-半乳糖苷酶的研究进展
• 1.3 外源基因表达系统
• 1.3.1 原核生物的表达系统
• 1.3.2 真核生物的表达系统
• 1.4 酸性磷酸酶的概念
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 α-半乳糖苷酶基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 引物合成
• 2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 Geobacillus属的菌株基因组DNA的提取
• 2.2.2 α-半乳糖苷酶基因组DNA片段的扩增
• 2.2.3 酶切
• 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 玻璃奶法纯化回收DNA片段
• 2.2.6 连接
• 2.2.7 感受态细胞的制备
• 2.2.8 质粒DNA的转化
• 2.2.9 筛选重组子
• 2.2.10 碱法少量快速抽提质粒DNA
• 2.2.11 α-半乳糖苷酶序列测定、同源性比较
• 2.3 结果
• 2.3.1 α-半乳糖苷酶基因的扩增
• 2.3.2 α-半乳糖苷酶基因的测序结果及编码序列分析
• 2.3.3 α-半乳糖苷酶基因推测氨基酸序列信号肽的预测
• 2.3.4 α-半乳糖苷酶氨基酸序列的同源性比较分析
• 2.4 讨论
• 第三章 α-半乳糖苷酶基因的异源表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 引物合成
• 3.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 实验仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 质粒DNA的大量提取
• 3.2.2 真核重组表达载体的构建
• 3.2.3 质粒DNA的处理
• 3.2.4,酵母感受态的制备
• 3.2.5 酵母细胞的转化
• 3.2.6 转化子的筛选
• 3.2.7 目的基因在毕赤酵母中的表达检测
• 3.2.8 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵
• 3.2.9 重组α-半乳糖酶的纯化
• 3.2.10 粗酶液的制备
• 3.2.11 HiTrap Q Sepharose XL层析
• 3.2.12 酶活性测定
• 3.2.13 α-半乳糖苷酶的最适pH测定
• 3.2.14 α-半乳糖苷酶的反应最适温度
• 3.2.15 SDS-PAGE
• 3.2.16 非变性PAGE
• 3.2.17 活性染色
• 3.3 结果
• 3.3.1 真核表达质粒的构建与鉴定
• 3.3.2 α-gal-g基因在毕赤酵母中的表达
• 3.3.3 α-半乳糖苷酶的活性染色
• 3.3.4 标准曲线的绘制
• 3.3.5 发酵罐水平α-半乳糖苷酶的表达
• 3.3.6 粗酶酶学性质的初步鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 高温酸性磷酸酶acp基因的克隆与功能鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 基因操作
• 4.2.2 引物设计和PCR扩增
• 4.2.3 重组表达载体的构建
• 4.2.4 序列分析
• 4.2.5 acp基因在大肠杆菌中的表达
• 4.2.6 酸性磷酸酶活性的测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 acp基因的扩增
• 4.3.2 acp基因的测序结果及编码序列分析
• 4.3.3 ACPase氨基酸序列的同源性比较分析
• 4.3.4 原核表达质粒的构建与鉴定
• 4.3.5 acp基因在大肠杆菌中的表达
• 4.3.6 ACPase酶活的检测
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 5.1 结论
• 5.2 未来需要解决的问题
• 参考文献
• 缩略语表
• 攻读硕士期间公开发表论文
• 致谢
• 详细摘要