线虫（C.elegans）tra-1基因跨内含子克隆及其可变性剪接初步分析

论文摘要

真核基因表达调控是生命科学研究的前沿、热点。RNA的选择性剪接在真核基因表达调控中起着十分重要的作用。真核细胞mRNA前体经过剪接成为成熟的mRNA,而mRNA前体的选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度。而内含子内部的组成结构对可变性剪接具有重要的影响。虽然这些作用机制还不是很清楚,但从生物进化的观点看来,这部分序列必定具有重要的生物功能。因此,分析基因内部内含子的组成结构,对进一步了解基因功能和表达的分子机制具有十分重要的意义。 秀丽隐杆线虫（Caeborhabditis elegans）是重要的模式生物之一。tra-1基因是其性别决定中最重要的基因之一。在秀丽隐杆线虫性别决定信号通路中tra-1基因处于一系列基因调控的终端,因此它在性别控制中具有决定性的作用。tra-1基因编码锌指蛋白,在第二和第三锌指间的内含子处发生可变性剪接,并使该基因具有两个mRNA产物:一个1.5kb转录产物编码两锌指蛋白;另一个5kb转录产物编码五锌指蛋白。tra-1基因通过可变剪接加工来改变mRNA的3’末端,进而改变产物蛋白不同的活性。 本文在tra-1基因的第一和第五锌指处分别设计上下游引物,通过对线虫基因组PCR得到约3.3kb片段,然后连接到T载体pBS-T上并转化大肠肝菌TG1,待大量扩增后,经PCR检测得到3.3kb片段,证实质粒重组构建成功,经测序证实克隆序列为tra-1基因五个锌指部分。通过比较测得序列和其mRNA序列发现1.5kb转录产物3’末端停在内含子的polyA处,而该内含子二级结构进一步表明该polyA位于二级结构的活性部位,而5’剪接信号GU则随内含子结构的变化而处于不同位置,因此可能使tra-1基因产生可变性剪接。 综上所述,本项研究的创新之处在于首次通过秀丽隐杆线虫基因组用PCR方法克隆tra-1基因的锌指部分序列,不仅发现其内含子序列的组成结构对其可变性剪接有重要的影响,而且本研究结果将对克隆昆虫病原等索科线虫的相关性别决定基因提供参考价值和比较基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 真核生物内含子可变性剪接
• 1.1.1 mRNA剪接的基本模式
• 1.1.2 选择性剪接的基本形式
• 1.1.3 交替剪接的调控
• 1.1.3.1 顺式元件和反式作用因子的影响
• 1.1.3.2 RNA前体的内部结构状况
• 1.1.3.3 剪接末端的选择调控
• 1.1.3.4 GC-AG型内含子的剪接
• 1.1.3.5 RNA编辑调控选择性剪接
• 1.2 秀丽隐杆线虫tra-1基因研究相关进展
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 线虫（C.elegans）的来源
• 2.1.2 Taq酶、限制性内切酶及其它工具酶
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 抗菌素
• 2.1.5 常用贮存液
• 2.1.6 培养基
• 2.1.7 常用缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 线虫的饲养及其总DNA的提取
• 2.2.2 特异性PCR扩增目的DNA片段及分析
• 2.2.3 目的DNA片段的凝胶回收
• 2.2.4 目的DNA片段与pBS-T载体的连接
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6 重组质粒的提取
• 2.2.7 重组质粒的筛选与鉴定
• 2.2.8 测序
• 3 实验结果与分析
• 3.1 PCR扩增目的基因片段
• Z鉴定'>3.2 重组质粒PSB_Z鉴定
• 3.3 测序确定目的基因片段
• 3.4 线虫锌指基因三个内含子比较和分析
• 3.5 锌指基因的可变性剪接分析
• 4 讨论
• 4.1 线虫内含子剪接信号序列
• 4.2 tra-1基因可变性剪接及其实践意义
• 4.3 对索科线虫问题研究的建议
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 硕士期间发表论文
• 致谢