拟南芥RDR1基因启动子的表达特征分析

论文摘要

基因沉默作为一种广泛的基因表达调节机制,充分利用了小RNA分子及相关蛋白因子以序列特异性的方式抑制转录或导致mRNA切割。在若干参与基因沉默的蛋白因子中,其中有一个重要的成分就是依赖于RNA的RNA聚合酶（RDR）。它能以单链RNA为模版合成互补RNA链,产生双链RNA。双链RNA在细胞内被类似RNase III的酶DCL加工成2024nt的小分子干扰RNA（siRNA）,从而实现在转录水平或转录后水平抑制靶基因的表达。RDR通过基因沉默途径参与了植物的生长发育调节、逆境应答以及表观遗传修饰等许多生物学过程。在植物中RDR基因主要以基因家族的形式存在,并且不同家族成员具有不同的生物学功能。正向遗传学研究表明,拟南芥AtRDR1主要参与了植物对病毒的防御,而拟南芥AtRDR6不但具有防御病毒的能力还参与了逆境应答和生长发育的调节过程。另外,它们的表达受到不同内源信号分子和逆境胁迫的影响。为了进一步阐明拟南芥AtRDR1的抗病机制和挖掘其生物学功能,开展对其表达特征的分析具有重要意义。本研究克隆了拟南芥AtRDR1基因的全长启动子,并利用缺失法获得了5种不同缺失的启动子;将这6种启动子替换pCAMBIA 1303的CaMV 35S启动子,以驱动GUS-GFP融合基因的表达;将转基因拟南芥进行表达模式分析、内源信号分子和逆境胁迫应答分析;最后进行了突变体表型观察。所获实验结果如下:1. AtRDR1基因主要在植物维管系统的韧皮部和成熟果荚中高表达,不在顶端分生组织及新生器官中表达,如根尖、茎尖、幼嫩真叶、幼嫩花蕾及幼嫩种荚。2. AtRDR1基因受NAA、JA、GA3和冷处理的诱导表达;但NaCl、SA、ABA和PEG6000处理却抑制该基因的表达。其中NAA、SA和盐处理变化最为明显。3.与缺失型启动子相比,AtRDR1基因全长启动子表达能力最强。-1088-690区和5’UTR内含子,即+112+199区,对AtRDR1基因表达的强弱有重要影响;-434+215区是维持基因基本表达所必须的。5’UTR内含子能提高细胞内GUS-GFP转录本的累积量,最终导致基因表达量升高。4.在AtRDR1基因启动子的-1088-690区含有应答植物生长激素的正调控元件和脱水应答的负调控元件;在-690-434区含有应答低温的正调控元件;5’UTR内含子含有JA应答的负调控元件。5. AtRDR1基因在拟南芥种荚的发育过程中起到一定作用。它的突变将导致种荚变短和种子数量变少,但对拟南芥种子的萌发、根的生长、叶片形态、开花时间以及种子大小没有影响。上述研究结果丰富了对拟南芥AtRDR1表达调控机制的认识、揭示了它新的生物学功能、也为深入揭示其抗病机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 基因沉默
• 1.2 依赖于RNA 的RNA 聚合酶
• 1.2.1 依赖于RNA 的RNA 聚合酶的基因家族
• 1.2.2 植物RDR 基因的表达调节
• 1.2.3 植物RDR 的生化活性
• 1.2.4 植物RDR 基因的生物学功能
• 1.3 内含子的功能
• 1.4 研究拟南芥AtRDR1 基因表达特征的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种与载体
• 2.1.3 试剂盒、酶及其它试剂
• 2.1.4 引物合成及测序
• 2.1.5 实验仪器
• 2.1.6 序列分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.2 大肠杆菌感受态的制备、电击转化及转化子检测
• 2.2.3 根癌农杆菌感受态的制备、电击转化及转化子检测
• 2.2.4 拟南芥的栽培与转化
• 2.2.5 拟南芥基因组DNA 的提取
• 2.2.6 转基因拟南芥的抗性筛选及分子鉴定
• 2.2.7 半定量方法检测基因表达量
• 2.2.8 GUS 活性的组织化学染色分析
• 2.2.9 GUS 表达量的荧光定量分析
• 2.2.10 GFP 表达的细胞学观察
• 第三章 结果与分析
• 3.1 AtRDR1 基因启动子序列的生物信息学分析
• 3.2 植物表达载体的构建和转基因拟南芥的获得
• 3.3 AtRDR1 基因表达模式分析
• 3.4 全长启动子对外界信号的应答分析
• 3.5 缺失型启动子表达能力的分析
• 3.6 缺失型启动子对外界信号的应答分析
• 3.7 突变体表型的观察
• 第四章 讨论
• 第五章 结论与创新点
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历