论文摘要
第一部分单核细胞趋化蛋白—1对系膜细胞增殖及纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原表达的影响趋化因子（Chemokine）是不同类型细胞分泌的分子量相对较小（8—10kD）的细胞因子，它们对各自白细胞亚类如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞具有趋化作用而得名。单核细胞趋化蛋白—1（Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）属于趋化因子CC亚家族，是免疫细胞、炎症细胞和肾脏固有细胞分泌的一种化学趋化因子。所有的肾脏固有细胞如内皮细胞、系膜细胞、小管上皮细胞及间质细胞在免疫复合物、毒素、低氧缺血等刺激下都可释放趋化因子。趋化因子增多，可促使肾组织中单核—巨噬细胞、T淋巴细胞的浸润。浸润肾脏的白细胞又能分泌大量的细胞因子，形成正反馈，加剧炎症反应，炎症反应的持续导致细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的积聚，肾脏的纤维化，肾小球的硬化和慢性肾衰竭的进展。新近研究发现，MCP-1不仅趋化循环中的单核／巨噬细胞到肾小管间质，而且直接刺激肾脏固有细胞，启动或扩大炎症反应，导致ECM的积聚，肾脏的纤维化。正常情况下，系膜细胞仅行使收缩、吞噬和维持基质的正常代谢等功能。在系膜增生性肾小球肾炎（Mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN）发病过程中，系膜细胞（Mesangial cells, MCs）不仅是受害者，而且还通过分泌多种炎症因子及细胞外基质，主动参与肾小球肾炎的发病过程。然而有关MCP-1能否可以直接刺激MCs的增殖，促进ECM如纤维连接蛋白（Fibronectin, FN）和Ⅰ型胶原（Collagen TypeⅠ，COL I）的合成与分泌的研究报道尚少。本实验在大鼠系膜细胞的体外培养体系中，观察MCP-1能否直接刺激系膜细胞的增殖，能否促进系膜细胞分泌细胞外基质，从而阐明MCP-1在MsPGN发病过程中的作用，从新的视角探讨MsPGN发病机制，加深对其发病机制的认识。目的观察不同浓度的MCP-1对体外培养的大鼠系膜细胞增殖及纤维连接蛋白（FN）和Ⅰ型胶原（COL I）基因和蛋白质表达的影响。方法1、摸索体外培养的大鼠系膜细胞的生长规律，绘制细胞生长曲线；2、MCP-1的毒性实验；3、MCP-1的浓度梯度实验；4、不同终浓度的MCP-1（12.5，25，50，100ng／ml）刺激体外培养的系膜细胞，于不同时间（12h，24h，48h）应用MTT法测定系膜细胞增殖活性；5、不同终浓度的MCP-1（0，25，50，100ng／ml）刺激体外培养的系膜细胞，于不同时间（12h，24h，48h）应用半定量RT-PCR法测定系膜细胞FN和COL I mRNA的相对表达量；6、不同终浓度的MCP-1（0，25，50，100ng／ml）刺激体外培养的系膜细胞，于不同时间（12h，24h，48h）应用Western Blot的方法测定系膜细胞FN和COL I蛋白的相对表达量。结果1、大鼠系膜细胞在2.5～20％FCS RPMI1640培养液中能正常生长，传代12h后开始贴壁生长，进入对数生长期，细胞数量增加，体积增大，细胞呈圆形或梭形，细胞间有纤维丝连接；72h后细胞贴满瓶底，细胞紧密接触生长，进入平台期；2、台盼蓝实验显示，不同终浓度的MCP-1（3.125，6.25，12.5，25，50，100，200 ng／ml）对体外培养的大鼠系膜细胞连续观察72h，细胞生长状况良好，细胞成活率均在97％以上，未发现MCP-1的任何毒副作用；3、MCP-1的浓度梯度实验显示，不同终浓度的MCP-1（3.125，6.25，12.5，25，50，100，200ng／ml）刺激体外培养的大鼠系膜细胞，当浓度为12.5ng／ml时，随着培养时间的延长（24h，48h）才表现为增殖活性，低浓度者不表现增殖活性，MCP-1浓度为100ng／ml与200ng／ml组48h和72h时的增殖活性没有显著性差异（p＞0.05）；4、MCP-1对MCs增殖活性的影响：不同终浓度的MCP-1（12.5，25，50，100ng／ml）刺激体外培养的系膜细胞，当MCP-1浓度为12.5ng／ml时，与正常对照组比较，12h时MCs的增殖活性无显著性差异（p＞0.05），但随着培养时间的延长（24h，48h），则表现有差异（p＜0.05）；当MCP-1浓度等于或大于25ng／ml时，MCP-1能明显刺激大鼠MCs的增殖（p＜0.01），且表现为浓度和时间依赖性；5、MCP-1对大鼠系膜细胞FN、COL I mRNA表达的影响：正常培养条件下，大鼠系膜细胞有少量的FN和COL I mRNA的表达，随着MCP-1干预浓度的增加和培养时间的延长，与正常对照组比较，FN和COL I mRNA的表达明显增强（p＜0.01），不同浓度MCP-1组之间比较亦有差异（p＜0.05），呈现浓度和时间依赖性；6、MCP-1对大鼠系膜细胞FN、COL I蛋白表达的影响：正常培养系膜细胞中有基础量FN和COL I的分泌，加入不同终浓度的MCP-1（25，50，00ng／ml），24h时只有MCP-1 100ng／ml组FN、COL I的蛋白含量上升较正常组具有显著性差异（p＜0.05），随着培养时间的延长，不同浓度MCP-1组FN、COL I的分泌较正常组具有显著性差异（p＜0.01），并且不同浓度MCP-1组之间亦具有显著差异（p＜0.05）。结论在体外培养的大鼠系膜细胞体系中，MCP-1能促进大鼠系膜细胞的增殖、上调细胞FN和COL I的基因表达、促进FN及COL I蛋白质的合成与分泌。提示MCP-1在MsPGN发病过程中起一定的作用。从新的视角探讨了MsPGN的发病机制，加深对其发病机制的认识。第二部分P38MAPK／NF-κB信号通路在MCP-1介导系膜细胞增殖及细胞外基质合成中的调控作用P38丝裂素活化蛋白激酶（Mitogen—activated protein kinase, MAPK）是有丝分裂素活化的蛋白激酶家族的一个成员，通过对细胞内信号的传递参与细胞对外界许多刺激的调节反应，是多种细胞因子、炎症介质调控细胞增殖、分化与凋亡的共同早期信号通路。P38MAPK是通过非磷酸化转化为磷酸化状态而促进底物的磷酸化来实现信号的快速传递。P38MAPK活化后可于转录及转录后水平调节转录因子如ATF2, ALP-1, c-jun, c-fos, CREB, CHOP, Elk—1, MEF2C和NF-κB等。核转录因子—κB（Nuclear factor—kappaB，NF-κB）是一种介导细胞内信号转导的重要核转录因子。一般情况下，NF-κB是以P50-P65-IκB结合成三聚体以无活性的形式存在于细胞浆中。目前已发现它调节着100多种靶基因的表达，如细胞因子、化学趋化因子、生长因子、粘附分子、纤维连接分子和胶原蛋白分子等，多数均参与宿主的免疫和炎症反应。在许多实验性肾小球肾炎如抗肾小球基底膜肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、免疫复合物性肾小球肾炎等模型中均可见肾小球或肾皮质中NF-κB活性的增加。SB203580（简称SB）是一种吡啶咪唑类抑制剂，它可以通过与ATP竞争性地结合其ATP结合位点而特异性地抑制P38MAPK的活性，是一种特异性强、安全有效的工具药。从实验第一部分结果可以看出：在体外培养的大鼠系膜细胞的培养体系中，不同浓度的MCP-1（25，50，100ng／ml）以剂量和时间依赖性地刺激系膜细胞的增殖、细胞外基质纤维连接蛋白和1型胶原的分泌，但上述过程中的胞内信号是怎样传递的呢?是否与P38MAPK／NF-κB信号通路有关呢?本部分主要探讨P38MAPK／NF-κB信号通路在MCP-1介导系膜细胞增殖及细胞外基质合成中的调控作用。目的在体外培养的大鼠系膜细胞培养体系中，探讨P38MAPK／NF-κB信号通路在MCP-1介导系膜细胞增殖及细胞外基质纤维连接蛋白和1型胶原合成中的调控作用。方法1．MTT法测定单纯不同终浓度SB（1，5，10μmol／L）于不同时间（12h，24h，48h）对正常培养的大鼠系膜细胞增殖活性的影响；2、MTT法测定MCP-1（100ng／ml）及MCP-1（100ng／ml）+不同浓度SB（1，5，10μmol／L）于不同时间（12h，24h，48h）对大鼠系膜细胞增殖活性的影响；3、Western Blot法于不同时间（15’，30’，60’，120’）测定正常培养的大鼠系膜细胞P38MAPK磷酸化水平；4、Western Blot法于不同时间（12h，24h，48h）测定正常培养的大鼠系膜细胞NF-κBP65蛋白的表达；5．Western Blot法测定不同终浓度的MCP-1（25，50，100ng／ml）及MCP-1（100ng／ml）+SB（10μmol／L）组于不同时间（15’，30’，60’，120’）对大鼠系膜细胞P38MAPK磷酸化水平的影响；6、Western Blot法测定不同终浓度的MCP-1（25，50，100ng／ml）及MCP-1（100ng／ml）+SB（10μmol／L）组于不同时间（12h，24h，48h）对大鼠系膜细胞NF-κBP65表达的影响；7、半定量RT-PCR法测定不同终浓度的MCP-1（25，50，100ng／ml）及MCP-1（100ng／ml）+SB（10μmol／L）刺激体外培养的系膜细胞，于不同时间（12h，24h，48h）系膜细胞FN和COL I基因的相对表达量；8、Western Blot法测定不同终浓度的MCP-1（25，50，100ng／ml）及MCP-1（100ng／ml）+SB（10μmol／L）刺激体外培养的系膜细胞，于不同时间（12h，24h，48h）系膜细胞FN和COL I蛋白的相对表达量。结果1．不同浓度的P38MAPK特异性阻滞剂SB203580（1，5，10μmol／L）于不同时间（12h，24h，48h）对正常培养的系膜细胞增殖活性无影响（p＞0.05）；但MCP-1（100ng／ml）+不同浓度的SB（1，5，10umol／L）共同培养的系膜细胞的增殖与MCP-1（100ng／ml）组比较明显受到抑制，经统计学处理具有明显的差异（p＜0.01），但不同浓度SB组间没有显著性差异（p＞0.05）；2．正常培养的大鼠系膜细胞于不同时间（15’，30’，60’，120’）有基础量P38MAPK磷酸化，但不同时间点之间无显著性差异（p＞0.05）；3．正常培养的大鼠系膜细胞于不同时间点（12h，24h，48h）未检测到NF-κBP65的表达；4．不同浓度MCP-1对大鼠系膜细胞P38MAPK磷酸化水平的影响：当MCP-1浓度为25ng／ml，培养15’时，系膜细胞P38MAPK磷酸化水平较正常组显著性增加（p＜0.01），30’时达到最高水平，60’，120’时有所下降，与正常组比较仍有显著性差异（p＜0.01），但二者之间比较没有显著性差异（p＞0.05）。其它不同MCP-1浓度组得出类似的变化规律；5．不同浓度MCP-1对大鼠系膜细胞NF-κBP65表达的影响：当MCP-1浓度为25ng／ml，培养12小时时，未检测到系膜细胞NF-κBP65的表达，但随着MCP-1浓度的增加和培养时间的延长，NF-κBP65表达水平明显增强并且各浓度组和时间点之间比较具有显著性差异（p＜0.01）；6．SB203580对大鼠系膜细胞P38MAPK磷酸化水平的影响：MCP-1（100ng／ml）+SB203580（10μmol／L）组，大鼠系膜细胞P38MAPK磷酸化水平受到明显的抑制，较MCP-1（100ng／ml）组具有显著性差异（p＜0.01）；7．SB203580对大鼠系膜细胞NF-κBP65表达的影响：MCP-1（100ng／ml）+SB203580（10μmol／L）组，大鼠系膜细胞NF-κBP65表达受到明显地抑制，较MCP-1（100ng／ml）组具有显著性差异（p＜0.01）；8．SB对大鼠系膜细胞FN、COL I mRNA表达的影响：正常培养条件下，大鼠系膜细胞有少量的FN和COL I mRNA的表达，随着MCP-1干预浓度的增加和培养时间的延长，与正常对照组比较，FN和COL I mRNA的表达明显增强（p＜0.01），不同浓度MCP-1组之间比较亦有差异（p＜0.05），呈现浓度和时间依赖性。加入SB10umol／L组，FN和COL I mRNA的表达明显受到抑制，与MCP-1（100ng／ml）组比较具有显著性差异（p＜0.01）。9．SB对大鼠系膜细胞FN、COL I蛋白表达的影响正常培养系膜细胞中有基础量FN和COL I的分泌。加入不同浓度的MCP-1（25，50，100ng／ml），12h时只有MCP-1 100ng／ml组FN、COL I的蛋白含量较正常组具有显著性差异（p＜0.01），随着培养时间的延长，不同浓度MCP-1组FN、COL I的分泌较正常组具有显著性差异（p＜0.01），不同浓度组之间亦具有显著性差异（p＜0.05）；MCP-1 100ng／ml+SB（10μmol／L）组FN、COL I的分泌较MCP-1（100ng／ml）组受到明显的抑制（p＜0.01），结论在体外培养的大鼠系膜细胞培养体系中，MCP-1对MCs的增殖作用能被P38MAPK特异性阻断剂SB所阻断；不同浓度的MCP-1能促进大鼠系膜细胞P38MAPK磷酸化并且活化核转录因子NF-κB；MCP-1呈时间和剂量依赖性地上调纤维连接蛋白和1型胶原基因及蛋白质的表达，上述过程亦能被P38MAPK特异性阻滞剂SB203580所阻断，提示P38MAPK／NF-κB信号通路在MCP-1介导系膜细胞增殖、细胞外基质纤维连接蛋白和1型胶原合成中起调控作用。本实验初步探讨了MCP-1致MsPGN发病过程中的胞内信号转导机制——P38MAPK／NF-κB信号通路，可能为临床寻求治疗MsPGN新的靶点提供一些实验依据。
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