论文摘要
目的流行性感冒是由流感病毒引起的一种呼吸道传染性疾病,给人们健康生活和社会经济带来严重危害.中医药在治疗流感方面具有独特的优势,临床疗效肯定,近年来的实验研究表明,中药不仅能抗病毒,还能发挥整体调节作用,通过调节免疫系统来发挥治疗病毒感染性疾病的作用。因此对中药治疗流感的免疫调节作用有进一步研究的必要。毒热平注射液是由黄芩、栀子、猪胆粉、灯盏花等四味药组成的中药复方制剂,四药共奏清热解毒、活血通络之功。本实验主要研究毒热平注射液对FM1感染后小鼠T细胞功能的影响,以明确中医药抗病毒作用机制,为中医药的临床应用和进一步实验研究提供理论依据。方法本实验共分为体内、体外两个部分:第一部分为体外实验,研究毒热平注射液体外对小鼠脾脏T细胞抗流感病毒（FM1）功能的影响。以BALB/c小鼠（SPF级）脾脏T细胞作为研究对象,实验分成毒热平注射液组,双黄连对照组,正常组和FM1感染模型组。主要研究内容有:①毒热平注射液对正常小鼠T细胞增殖功能和产生IFN-γ、IL-10的影响;②研究流感病毒（FM1）对Con A活化T细胞的影响及毒热平注射液的干预作用;③流感病毒（FM1）感染巨噬细胞培养上清对T细胞增殖和产生INF-γ的影响及毒热平注射液的干预作用;④毒热平注射液对小鼠T细胞杀伤流感病毒（FM1）感染巨噬细胞Ana-1的影响。第二部分为体内实验,研究毒热平注射液体内对FM1感染小鼠肺脏T细胞功能的影响。以ICR小鼠（SPF级）作为研究对象。实验分为七组:毒热平注射液大、中、小剂量组,双黄连组,利巴韦林组,FM1感染模型组,正常组。FM1感染小鼠造模后,上述各组小鼠感染当天分别给予药物腹腔注射,每天1次,连续7天后摘取肺组织,计算肺指数,用RT-PCR法测定肺组织中INF-γmRNA,IL-4 mRNA基因转录水平的改变,用Wstern-blot法检测肺组织中CD40L蛋白表达水平的变化。结果第一部分体外实验1.毒热平注射液对正常小鼠T细胞增殖功能和产生IFN-γ、IL-10的影响毒热平注射液17μg/ml和8.5μg/ml能明显抑制诱导的小鼠脾脏T细胞增殖,同时还能明显抑制conA诱导的脾脏T细胞IL-10的产生,毒热平注射液17μg/ml能明显增强conA诱导的脾脏T细胞IFN-γ的产生。2. FM1对Con A活化T细胞的影响及毒热平注射液的干预作用⑴FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用12h后换液继续培养至36h,模型组与正常组比较,淋巴细胞数目显著减少,毒热平注射液17μg/ml能显著上调病毒诱导的淋巴细胞数目减少;加药作用24h后换液继续培养至36h,模型组与正常组比较,淋巴细胞数目显著减少,毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml和4μg/ml能显著上调病毒诱导的淋巴细胞数目减少;加药作用36h后,模型组与正常组比较,淋巴细胞胞数目显著减少,毒热平注射液组与正常组模型组比较均没有显著性差异。⑵FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用12h后,模型组细胞上清中的IFN-γ、IL-10水平显著高于正常组,毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml细胞上清中的INF-γ水平显著高于正常组,毒热平注射液8.5μg/ml、2μg/ml细胞上清中的INF-γ值显著低于模型组,毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml和2μg/ml细胞上清中的IL-10值显著低于模型组;FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用24h后,流感病毒FM1感染脾细胞24h后,正常组产生的INF-γ、IL-10在ConA刺激下增长到最高,模型组细胞上清中产生的INF-γ、IL-10减少,显著低于正常组。毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml和2μg/ml组仍然能维持INF-γ量在较高水平,浓度显著大于模型组,与正常组比较无显著差异,而毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml组的IL-10水平显著低于模型组;流感病毒FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用36h后,各组上清中的INF-γ、IL-10水平均比前面时段明显下降,且没有显著性差异。3.FM1感染巨噬细胞培养上清对T细胞增殖和产生INF-γ的影响及毒热平注射液的干预作用FM1感染预先加药后的巨噬细胞（Ana-1）,8h的细胞上清,加入Con A诱导过的小鼠脾细胞后,模型组的脾脏T细胞增值水平与正常组比较没有显著差异,但产生的INF-γ显著高于正常组,毒热平注射液8.5μg/ml、2μg/ml组与模型组比较,能明显上调脾脏T细胞增值水平,且17μg/ml、8.5μg/ml组产生的INF-γ显著高于模型组;12h的细胞上清,加入Con A诱导过的小鼠脾细胞后,模型组脾细胞增值水平明显低于正常组,产生的INF-γ水平与正常组比较没有显著性差异,毒热平注射液17ug/ml、8.5μg/ml、24μg/ml组与模型组比较,能明显上调脾脏T细胞增值水平,毒热平注射液17ug/ml组产生的INF-γ显著高于模型组;24h的细胞上清,加入Con A诱导过的小鼠脾细胞后,模型组脾细胞增值水平明显低于正常组,产生的INF-γ亦显著低于正常组,毒热平注射液组脾细胞增值水平与模型组没有显著性差异,但毒热平注射液17ug/ml、8.5μg/ml组产生的INF-γ显著高于模型组。4.毒热平注射液对小鼠T细胞杀伤FM1感染巨噬细胞Ana-1的影响T细胞作用于FM1感染后的Ana-1细胞12h后,当效靶比例E/T=100:1时,模型组的杀伤率明显低于正常组,毒热平注射液17μg/ml组杀伤效率明显高于模型组;当效靶比例E/T=50:1时,模型组杀伤率仍低于正常组,但无明显差异,毒热平注射液C=17ug/ml和DRP2C=8.5ug/ml组杀伤效率均明显高于模型组. T细胞作用于FM1感染后的Ana-1细胞24h后,模型组与正常组杀伤效率没有显著差异;当效靶比例E/T=100:1时,毒热平注射液17μg/ml、C=8.5ug/ml组杀伤效率明显高于模型组;当效靶比例E/T=50:1时,毒热平注射液17μg/ml、C=8.5ug/ml和C=2ug/ml组杀伤效率均明显高于模型组;当效靶比例E/T=25:1时,毒热平注射液2μg/ml组杀伤率明显大于模型组。第二部分体内实验1.毒热平注射液对FM1感染小鼠肺指数的影响毒热平注射液作用于流感病毒FM1感染的小鼠7天后,模型组的肺指数明显高于正常组,利巴韦林组、双黄连组、毒热平大剂量组、毒热平中剂量组、毒热平小剂量组与模型组比较,肺指数均明显降低,其中以毒热平中剂量组最好,且可以看出该组小鼠体重增长与正常组比较没有显著性差异.2.毒热平注射液对FM1感染小鼠肺组织中IL-4、INF-γmRNA转录的影响毒热平注射液作用于流感病毒FM1感染的小鼠7天后,模型组的IL-4、INF-γmRNA转录水平均明显高正常组,毒热平注射液能降低流感病毒FM1感染小鼠肺组织中IL-4mRNA基因转录,且IL-4mRNA基因转录水平与浓度成反向关系,但毒热平注射液祖的IL-4mRNA基因转录水平明显高于利巴韦林组;毒热平注射液能增强流感病毒FM1感染小鼠肺组织中IFN-γmRNA基因转录,且INF-γmRNA基因转录水平与毒热平的浓度呈正向相关性,大剂量组与中剂量组与利巴韦林比较没有显著性差异。3.毒热平注射液对FM1感染小鼠肺组织T细胞CD40L蛋白表达的影响毒热平注射液作用于流感病毒FM1感染的小鼠7天后,模型组的CD40L蛋白表达水平明显高正常组,毒热平注射液能抑制流感病毒FM1感染小鼠肺组织中CD40L蛋白表达,抑制效果与浓度呈正向相关性,但毒热平注射液组CD40L表达水平显著高于正常组与利巴韦林组。结论毒热平注射液体外能抑制Con A诱导的正常小鼠脾细胞的增殖,抑制Th2型细胞因子IL-10的产生,促进Th1型细胞因子IFN-γ的产生;能保护FM1感染的的小鼠脾细胞,并抑制其产生Th2型细胞因子IL-10,而使Th1型细胞因子IFN-γ水平保持在一定的范围内;其预先作用巨噬细胞,再经FM1感染,各时段的巨噬细胞上清能促进T细胞的增殖能力和IFN-γ的表达;还能直接增强T细胞对FM1感染的靶细胞的杀伤能力。毒热平注射液体内能降低FM1感染小鼠的肺指数,且对小鼠的体重抑制作用小;增强FM1感染小鼠肺组织IFN-γmRNA基因转录,抑制IL-4mRNA基因转录,从而调节Th1型和Th2型T细胞的分化;还能抑制FM1感染小鼠肺组织CD40L蛋白的表达。实验说明毒热平注射液作用的多靶点性,通过调节免疫系统的平衡,增强机体进行有利于抗病毒的免疫应答,而又不产生过强的病理性炎症反应,且对小鼠的毒副作用少。
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