论文摘要
研究目的脑血管病是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。在脑血管病中,缺血性脑血管病（Ischemic Cerebral Vesscular Disease,ICVD）约占80%。脑是人体对缺氧最为敏感的器官,脑组织缺血将会导致局部脑组织及其功能的损害,及时地恢复血液再灌注有利于减轻脑缺血损伤,然而,缺血后血流的恢复在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍,这种恢复血流灌注后的有害情况称为缺血再灌注损伤（cerebral ischemia and reperfusion injury,CIRI）。抑制再灌注损伤已经成为目前治疗缺血性脑血管病的关键环节。目前治疗脑缺血病的药物往往作用机制单一,毒副作用较大,而中药多可以从多个层次和多个环节上起到治疗作用,因此研究和阐明中药治疗脑缺血病的机制具有重大的理论和临床价值。缺血性脑血管病与中医血瘀证紧密相关,中医治疗多采用活血化瘀法,配伍理气药以行气活血。川芎为临床常用活血化瘀药,具有活血行气之效,是临床常用于治疗缺血性脑血管病的中药之一。前期研究中,我们已经阐明川芎的有效成分川芎嗪可以透过正常和缺血再灌注时的血脑屏障;盐酸川芎嗪在对脑缺血再灌注损伤起到了保护作用,其作用机制与降低脑水肿、调节星形胶质细胞对损伤的反应、抗自由基损伤、降低NO毒性、防止血管痉挛、抗细胞凋亡、减少神经细胞变性坏死以及基因调控等多方面关系密切。然而,结合脑缺血再灌注损伤发生发展的多中心环节,我们有必要进一步探究川芎嗪的神经保护机制:川芎嗪是否可以调控兴奋性氨基酸增加、细胞内Ca2+超载、毒性自由基产生、细胞凋亡和炎性细胞损害等脑缺血再灌注损伤发生发展的中心环节。希望通过此研究为临床使用川芎或川芎嗪治疗脑缺血病提供理论依据,同时为今后研究和筛选治疗脑缺血病的中药提供一个更加坚实的实验方法学平台。研究方法我们首先建立了大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血（MCAO）再灌注体内实验动物模型,采用免疫组化和实时荧光定量PCR,观察了川芎嗪对大鼠脑组织Bax/Bcl-2蛋白和mRNA表达的影响。然后,根据脑缺血再灌注损伤的病理生理机制,应用常用的神经细胞株一大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）,制备了4种脑缺血再灌注损伤细胞模型:谷氨酸模型、过氧化氢模型、咖啡因模型和二甲酰胺模型。在这些模型中进行了以下的研究:（1）应用CCK-8法检测川芎嗪在这些模型中是否具有神经保护作用;（2）应用Hoechst-33342染色,荧光显微镜观察凋亡细胞;应用流式细胞术检测细胞凋亡率和caspase活性;应用罗丹明染色检测线粒体膜电位;应用实时荧光定量PCR检测凋亡调控蛋白Bax和Bcl-2的mRNA水平;观察了川芎嗪在上述4种PC12脑缺血再灌注损伤细胞模型中是否可以干预凋亡以及川芎嗪的作用机制;（3）应用ELISA检测炎症性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α;应用western-blot检测高迁移率族蛋白B1（HMGB1）,探讨4种细胞模型中炎症相关性细胞因子的改变以及川芎嗪的保护效应和机制;（4）应用电泳迁移实验（EMSA）检测了核因子（NF-κB）的活性,进而分析川芎嗪是否可以通过干预NF-κB的活性而缓解脑缺血再灌注损伤;（5）检测4种细胞模型中氧化应激指标SOD、MDA、LDH和GSH/GSSG,探讨川芎嗪干预毒性自由基产生的机制。结果（1）在MCAO再灌注模型中,Bax/Bcl-2在蛋白和mRNA水平上都显著提高;高剂量川芎嗪预处理,则降低Bax/Bcl-2比值。（2）CCK-8法显示谷氨酸、过氧化氢、咖啡因和二甲酰胺具有细胞毒性,川芎嗪预处理后呈剂量依赖性的降低PC12细胞损伤。（3）Hoecsht染色可观察到谷氨酸、过氧化氢、咖啡因或二甲酰胺处理后,PC12细胞发生凋亡;1mM川芎嗪预处理后,PC12细胞核固缩和凋亡小体明显减少。（4）AV/PI流式细胞术显示谷氨酸、过氧化氢、咖啡因或二甲酰胺处理后,PC12细胞凋亡率显著提高;川芎嗪预处理后,PC12细胞凋亡率呈剂量依赖性降低。（5）caspase活性检测显示,谷氨酸、过氧化氢、咖啡因或二甲酰胺可致PC12细胞caspase-3和caspase-9活性升高,川芎嗪预处理后剂量依赖性的降低caspase-3和caspase-9活性。在谷氨酸、过氧化氢和二甲酰胺模型中,Caspase-8活性未见改变;咖啡因模型中,Caspase-8活性显著升高,川芎嗪预处理后可以剂量依赖性的降低其caspase-8活性。（6）罗丹明染色检测线粒体膜电位显示,谷氨酸、过氧化氢、咖啡因或二甲酰胺处理后,PC12细胞线粒体膜电位均显著降低;川芎嗪预处理后,可以剂量依赖性升高4种细胞模型线粒体膜电位。（7）Real-time PCR检测显示Bax/Bcl-2的比值在谷氨酸、过氧化氢、咖啡因或二甲酰胺处理后升高,川芎嗪预处理,则可剂量依赖性降低Bax/Bcl-2比值。（8）ELISA法显示4种细胞模型中IL-1β,IL-6和TNF-α分泌水平显著增高。川芎嗪预处理后,IL-1β分泌水平,在谷氨酸模型组和咖啡因模型组中显著增高,在过氧化氢模型组和二甲酰胺模型组中显著降低:IL-6分泌水平,在谷氨酸模型组和过氧化氢模型组及二甲酰胺模型组中未见显著改变,在咖啡因模型组中显著降低;TNF-α分泌水平,在谷氨酸模型组和咖啡因模型组中显著降低,过氧化氢模型组及二甲酰胺模型组中未见显著改变。（9）Western-blot显示,4种细胞模型中HMGB1水平显著增高。川芎嗪预处理后,HMGB1水平在谷氨酸模型组和咖啡因模型组中显著降低,过氧化氢模型组及二甲酰胺模型组中未见显著改变。（10）EMSA显示,谷氨酸模型组和咖啡因模型组及二甲酰胺模型组中,NF-κB活性显著降低:川芎嗪预处理后,NF-κB活性发生显著升高;过氧化氢模型组中,NF-κB活性显著增高;川芎嗪预处理后,NF-κB活性显著降低。（11）氧化应激指标显示4种细胞模型组中,各种指标的变化趋势大致相同,即谷氨酸、过氧化氢、咖啡因或者二甲酰胺都可以降低SOD,升高LDH和MDA,降低GSH/GSSG;川芎嗪预处理后,SOD上调,LDH和MDA下调,GSH/GSSG上调。结论与意义脑缺血再灌注的病理生理变化是多方面、多层次的。川芎嗪通过调控兴奋性氨基酸增加、细胞内Ca2+超载、毒性自由基产生、细胞凋亡和炎性细胞损害等脑缺血再灌注损伤发生发展的中心环节而改善脑缺血再灌注损伤。本实验研究的创新性体现在:（1）已有应用PC12细胞制备脑缺血再灌注损伤模型的文献报道,但将PC12细胞模型应用于川芎嗪作用机制的研究所涉甚少。本研究参考脑缺血再灌注损伤的发病机制,应用PC12细胞制备了兴奋性氨基酸模型（谷氨酸模型）、毒性自由基模型（过氧化氢模型）和钙离子超载模型（咖啡因模型）和氧化/抗氧化失衡模型（二甲酰胺模型）;并且应用于川芎嗪作用机制的研究。二甲酰胺作用后并不产生毒性自由基,但是可以干扰氧化/抗氧化平衡,是毒性自由基模型（过氧化氢模型）的补充。（2）在动物实验中,我们已经证实了川芎嗪具有保护效应;且保护效应与川芎嗪抗凋亡和抗氧化自由基形成等有关。本研究在前期工作基础上,应用多种细胞模型,将川芎嗪作用机制进一步拓展到抗凋亡、抗自由基形成和抗炎症效应;并且研究了HMGB1和NF-κB与川芎嗪抗脑缺血再灌注损伤的机制。（3）实验采用了多种检测方法,其中实时荧光定量PCR和凝胶迁移试验EMSA具有新意。（4）实验证明了川芎嗪在不同的模型中,可能通过不同的机制保护PC12细胞,丰富了川芎嗪的作用机制。（5）本实验为研究中药通过血脑屏障、抗脑缺血再灌注损伤建立了一整套实验方法学平台,对促进中药现代化具有重要意义。
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