重组人源LYG2和LYC5溶菌酶在毕赤酵母中的表达及活性研究

论文摘要

溶菌酶是一种天然的碱性蛋白,可专一性地作用于微生物细胞壁,通过切断肽聚糖中N-乙酰胞壁酸（NAM）与N-乙酰葡萄糖胺（NAG）之间的p-1,4-糖苷键之间的联结,引起细菌裂解。近年来,由于抗生素的滥用,越来越多的细菌产生了耐药性,耐药菌的出现给临床上治疗感染性疾病造成了重重困难,因此,寻找高效安全的,不产生耐药性的杀菌药物,成为一项重要工作。溶菌酶是一种可以杀死大部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌的天然抗菌蛋白。本实验室在早期的研究中发现和克隆了一系列溶菌酶蛋白,本研究对其中的LYG2和LYC5人溶菌酶进行了重组表达并测定了杀菌活性。人源g型溶菌酶包含LYG1和LYG2溶菌酶,其中LYG2是由本实验发现并获得了国内外专利,人源c型溶菌酶基因家族包含LYC1, LYC2, LYC3, LYC4,LYC5和LYC6 （hLYZ）溶菌酶,其中LYC1, LYC2, LYC3, LYC4和LYC6都已经在毕赤酵母或大肠杆菌表达系统中成功表达,而LYC5溶菌酶尚未被表达过。我们根据酵母密码子的偏好性设计了除去信号肽的LYG2和LYC5的成熟蛋白编码序列,为方便克隆,在其前后分别加上了Xho Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点,将编码基因按照质粒阅读框的翻译方向插入到表达质粒pPIC9K的多克隆位点中,构建重组表达质粒pPIC9K-LYG2和pPIC9K-LYC5。将测序结果正确的质粒,用SalI酶线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,转化子经最小葡萄糖培养基（MD）,最小甲醇培养基（MM）,以及G418抗性的筛选和酵母菌落PCR鉴定,获得了28株含多拷贝LYG2人溶菌酶基因和6株含LYC5人溶菌酶的重组毕赤酵母转化子。对重组菌株进行摇瓶诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,发现LYG2和LYC5重组菌株的表达上清分别在约20kD和15kD的位置出现了明显的蛋白条带,对蛋白条带进行质谱验证,结果证明此条带即LYG2溶菌酶蛋白,蛋白表达量约67mg/L和10mg/L,对重组表达上清进行活性分析,LYG2和LYC5重组菌株表达上清对艳红微球菌具有溶菌活性,活性分别约257U/ml和434U/ml,比活力为3,836U/mg和43,400U/mg。本研究利用基因工程手段,在毕赤酵母系统中成功表达出了LYG2溶菌酶蛋白和LYC5溶菌酶蛋白,并且在表达上清中检测到了溶菌活性,为LYG2和LYC5溶菌酶的大规模生产奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 载体
• 1.3 试剂及试剂盒
• 1.4 主要培养基及溶液的配制
• 1.5 主要仪器
• 1.6 生物信息途径及计算机程序
• 2 方法
• 2.1 目的基因的合成及引物设计
• 2.2 生物信息学分析
• 2.3 重组表达质粒的构建
• 2.4 转化毕赤酵母
• 2.5 含目的基因的高拷贝毕赤酵母转化子的筛选
• 2.6 酵母转化子的PCR鉴定
• 2.7 目的蛋白的摇瓶表达
• 2.8 重组表达蛋白的质谱鉴定
• 结果
• 1 LYG2和LYC5基因的合成及引物设计
• 2 LYG2和LYC5的生物信息学分析
• 3 pPIC9K-LYG2和pPIC9K-LYC5重组表达质粒的构建
• 4 线性化质粒转化毕赤酵母GS115
• 5 含目的基因的高拷贝毕赤酵母转化子的筛选
• 6 LYG2和LYC5重组酵母菌株的PCR鉴定
• 7 LYG2和LYC5表达上清的SDS-PAGE电泳分析及活性分析
• 8 LYG2和LYC5重组蛋白的质谱鉴定
• 讨论
• 参考文献
• 综述（一）
• 参考文献
• 综述（二）
• 参考文献
• 致谢