重组多杀性巴氏杆菌细菌幽灵的研究

论文摘要

多杀性巴氏杆菌是几种动物的重要病原菌,目前已经发现本菌有5种不同的荚膜型和16种菌体型。引起牛和水牛出血性败血症的为B:2和E:2型,引起禽霍乱的为A:1和A:3型,在我国导致猪肺疫的菌株为B型,而国外致猪肺疫的是A型。能够产生皮肤坏死毒素的A型和D型菌株是猪传染性萎缩性鼻炎的重要病原菌之一,F型菌株则引起火鸡不同程度的疾病。近年来,我国猪群由A型多杀性巴氏杆菌引起的猪肺炎病例逐渐增多。控制上述这些疾病的有效手段是免疫预防,但目前所有多杀性巴氏杆菌的疫苗都存在着免疫期短和保护率相对偏低的问题。同种弱毒活疫苗比灭活疫苗免疫效力相对高些,这就预示着灭活疫苗在制备过程中的抗原决定族可能被物理和化学处理而破坏。通过遗传灭活方法是保持天然抗原决定族的有效手段。为此,我们采用基因工程手段,从含有E基因的质粒pHH43中提取E基因,并将其克隆到适合转化野生型革兰氏阴性菌的穿梭质粒pPBA1100多克隆区,从而构建新的裂解决质粒,并以目前对养殖业危害较大的多杀性巴氏杆菌致病毒株为转化对象,构建细菌幽灵重组菌株。通过比色法、CFU和扫描电镜等分析,了解E裂解基因表达效果。利用免疫试验和攻毒试验评价多杀性巴氏杆菌幽灵的安全性。结果如下:1.经大肠杆菌扩繁后,带有E基因和温度诱导控制系统的质粒pHH43,用限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定,琼脂糖电泳出现5条谱带,各谱带分子量与理论值相符,提示E-基因与控制系统重组成功。2.通过内切酶SacⅠ水解质粒pHH43获得2条酶切片断,回收的E-基因盒片断与穿梭质粒pPBA1100杂交,构建了E-基因表达质粒pPBA1100-E。表达质粒转化构建了多杀性巴氏杆菌重组菌株。内切酶SacⅠ对重组菌株表达质粒酶切后,E-基因盒片段与质粒pUC19重组构建了测序质粒pUC19-E。E-基因盒测序结果表明,测定序列中包含E基因和控制系统cI857序列,同时表达质粒经内切酶酶切鉴定,证明重组菌株构建成功。3.重组菌株诱导表达试验,经生长曲线和扫描电镜检测证明E-基因能在重组菌株中表达,能形成多杀性巴氏杆菌细菌幽灵。4.重组菌株表达后,CFU检测显示重组菌的裂解率达到98.6%,免疫和攻毒试验表明,多杀性巴氏杆菌细菌幽灵可使小鼠产生较好的免疫保护,其保护率高达100%。本研究对于改变传统疫苗灭活方法、实现遗传灭活新思路和研究新型疫苗以及开辟动物疫苗新途径具有重要的理论和应用意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 细菌幽灵的研究进展
• 1.1.1 细菌幽灵的研究背景
• 1.1.2 细菌幽灵作为疫苗的优点
• 1.2 多杀性巴氏杆菌研究现状
• 1.2.1 多杀性巴杆菌的生理生化特性
• 1.2.2 多杀性巴杆菌的危害
• 1.2.3 多杀性巴杆菌的致病机理
• 1.3 选题意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及质粒
• 2.1.2 酶及主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要缓冲液及溶液配制
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DH5α感受态菌的制备
• 2.2.2 质粒提取
• 2.2.3 质粒的转化
• 2.2.4 质粒酶切
• 2.2.5 pPBA1100-E的构建及鉴定
• 2.2.6 测序质粒pUC19-E的构建及鉴定
• 2.2.7 多杀性巴氏杆菌幽灵的制备及鉴定
• 2.2.8 动物试验
• 第3章 结果与分析
• 3.1 pHH43的鉴定
• 3.2 pPBA1100的鉴定
• 3.3 目的片段及载体的提取
• 3.4 pUC19-E的酶切鉴定及E基因盒序列分析
• 3.5 pPBA1100-E的酶切鉴定
• 3.6 温控表达系统裂解水平的检测结果
• 3.7 扫描电镜观察结果
• 3.8 多杀性巴氏杆菌感染对小鼠最小致死剂量的测定结果
• 3.9 多杀性巴氏杆菌幽灵的安全性检测
• 3.10 免疫实验
• 第4章 讨论
• 第5章 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果