木霉来源纤维素酶的分离纯化及其酶学性质研究

论文摘要

本文研究了绿色木霉（Trichoderma viride）M1来源纤维素酶的分离纯化及其酶学性质。实验采用了DEAE-650C弱阴离子交换层析、CM-650M弱阳离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析和Octyl Sepharose CL-4B疏水层析等分离纯化技术,从绿色木霉M1发酵液中分离纯化得到四个具有内切葡聚糖酶活力的同工酶组分（EG1、EG2、EG3和EG4）,通过SDS-PAGE电泳鉴定表明这四个组分均为单一组分。纯化得到的内切葡聚糖酶组分EG1、EG2、EG3和EG4对羧甲基纤维素钠的比活力分别为41.83U/mg、139.96 U/mg、117.72 U/mg和126.50 U/mg,回收率分别为8.36%、11.31%、14.72%和24.31%,其纯化倍数分别为7.04倍、23.56倍、19.82倍和21.30倍。对纯化得到的四种同工酶组分的酶学性质进行研究。结果表明,四个内切葡聚糖酶组分EG1、EG2、EG3、EG4的分子量分别为25.4 kDa、28.8 kDa、56.3 kDa和60.5 kDa,最适反应温度分别为50℃、45℃、55℃和60℃,最适反应pH分别为6.0、5.0、4.0和5.0,米氏常数Km值分别为9.51mg/mL、5.06mg/mL、4.16 mg/mL和4.86mg/mL。温度稳定性和pH稳定性实验结果表明,组分EG1、EG3和EG4在30℃～50℃温度范围内较稳定,当温度超过60℃后稳定性有所下降,而组分EG2的温度稳定性较差,温度高于40℃后酶活力快速下降；在pH4.0-6.0的范围内,组分EGl、EG2和EG4的pH稳定性较好,而组分EG3的pH稳定性较差,只在pH5.0的条件下较稳定。不同金属离子对内切葡聚糖酶组分的影响不同,Zn2+、Mg2+和K+离子对EG4酶活有激活作用,却对EG1、EG2和EG3酶活有一定程度的抑制作用,而Ca2+离子对组分EG1、EG2和EG3有一定程度的激活作用。底物特异性的研究表明四种酶组分都对CMC有降解能力且对粘度高的CMC降解能力弱,其中EG2对木聚糖有一定的降解能力,EG4对微晶纤维素和纤维素粉的降解能力最大；对四种内切葡聚糖酶组分的纤维素结合域（CBD）研究表明EG1和EG4含有纤维素结合域,而EG1和EG3不具有。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 纤维素
• 1.2 纤维素酶
• 1.2.1 纤维素酶的分类
• 1.2.2 纤维素酶的降解机制
• 1.2.3 纤维素酶的来源
• 1.2.4 纤维素酶的生产
• 1.2.5 纤维素酶的分离纯化
• 1.2.5.1 沉淀法
• 1.2.5.2 透析
• 1.2.5.3 凝胶过滤
• 1.2.5.4 离子交换层析
• 1.2.5.5 疏水层析
• 1.2.5.6 亲和层析
• 1.2.6 纤维素酶的理化性质
• 1.2.6.1 纤维素酶的分子量
• 1.2.6.2 纤维素酶的最适作用温度及温度稳定性
• 1.2.6.3 纤维素酶的最适作用pH及pH耐受性
• 1.2.6.4 纤维素酶的动力学参数
• 1.3 本文研究的目的及意义
• 第二章 木霉来源纤维素酶的分离纯化
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌株来源
• 2.1.1.2 培养基
• 2.1.1.3 主要药品和分离介质
• 2.1.1.4 主要仪器和设备
• 2.1.1.5 主要试剂
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 菌株的培养及粗酶液的制备
• 2.2.2 内切葡聚糖酶（CMC酶）活力的测定
• 2.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2.2.2 CMC酶活力的测定
• 2.2.3 蛋白质浓度的测定
• 2.2.3.1 测定原理
• 2.2.3.2 测定方法
• 2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.4.1 电泳原理
• 2.2.4.2 电泳试剂的配制
• 2.2.4.3 电泳实验步骤
• 2.2.5 CMC活性电泳
• 2.2.5.1 活性电泳原理
• 2.2.5.2 活性电泳试剂的配制
• 2.2.5.3 活性电泳的实验步骤
• 2.2.5.4 粗酶液酶谱分析
• 2.2.6 透析
• 2.2.7 离子交换层析
• 2.2.8 凝胶层析
• 2.2.9 疏水层析
• 2.2.10 木霉来源纤维素酶粗酶液的分离纯化流程
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 绿色木霉粗酶液酶谱分析
• 2.3.2 DEAE-650C阴离子交换层析
• 2.3.2.1 对图2-4中活性蛋白峰1的分离纯化
• 2.3.2.2 对图2-4中活性蛋白峰2的分离纯化
• 2.3.2.3 对图2-4中活性蛋白峰3和4的分离纯化
• 2.3.3 各组分分离纯化过程中参数的变化
• 2.4 本章小结
• 第三章 绿色木霉不同内切葡聚糖酶组分的性质研究
• 3.1 实验材料和仪器
• 3.1.1 实验材料和仪器
• 3.2 实验方法步骤
• 3.2.1 蛋白分子量的测定
• 3.2.2 温度对绿色木霉内切葡聚糖酶组分的影响
• 3.2.3 绿色木霉内切葡聚糖酶组分的热稳定性
• 3.2.4 pH对绿色木霉内切葡聚糖酶组分的影响
• 3.2.5 绿色木霉内切葡聚糖酶组分的pH稳定性
• 3.2.6 绿色木霉内切葡聚糖酶组分反应动力学参数测定
• 3.2.7 金属离子对绿色木霉内切葡聚糖酶组分的影响
• 3.2.8 绿色木霉内切葡聚糖酶组分的底物特异性
• 3.2.9 绿色木霉内切葡聚糖酶组分纤维素结合域（CBD）的研究
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 标准蛋白分子量曲线
• 3.3.2 绿色木霉内切葡聚糖酶组分最适反应温度和热稳定性研究
• 3.3.2.1 不同内切葡聚糖酶组分的最适反应温度
• 3.3.2.2 不同内切葡聚糖酶组分的热稳定性
• 3.3.3 绿色木霉内切葡聚糖酶组分最适反应pH和pH稳定性研究
• 3.3.3.1 不同内切葡聚糖酶组分的最适反应pH
• 3.3.3.2 不同内切葡聚糖酶组分的pH稳定性
• 3.3.4 绿色木霉内切葡聚糖酶组分酶反应动力学参数研究
• 3.3.5 金属离子对绿色木霉内切葡聚糖酶组分的影响
• 3.3.6 绿色木霉内切葡聚糖酶组分的底物特异性
• 3.3.7 绿色木霉内切葡聚糖酶组分纤维素结合域（CBD）的研究
• 3.4 本章小结
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历