转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的实验研究

论文摘要

目的：在获得含目的基因pacA-ctxB, pacP-ctxB的转基因番茄第三代种子的基础上,应用PCR、Western blot、ELISA技术对转基因番茄进行鉴定及目的蛋白浓度测定,进一步对新西兰大白兔进行口服免疫实验,初步探索表达PAcA/CTB、PAcP/CTB嵌合蛋白的转基因番茄免疫大白兔的免疫效果。方法：本研究包括两个部分实验一：转基因番茄中外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB及外源目的蛋白的检测1.PCR法筛选含编码变异链球菌表面蛋白基因与霍乱毒素B亚单位融合基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的转基因番茄植株。2.BCA法测定总蛋白的含量。3.Westernblot确定目的蛋白的表达。4. ELISA法检测外源目的蛋白的浓度。实验二：转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的实验研究。1.动物的选择与分组：32只新西兰大白兔随机分为A、B、C、D四大组：其中A组包含三个剂量组：A1组：以7ml/kg剂量喂食表达PAcA/CTB嵌合蛋白的转基因番茄汁（含目的蛋白53.3μg）; A2组：以10ml/kg剂量喂食表达PAcA/CTB嵌合蛋白的转基因番茄汁（含目的蛋白76.20μg）;A3组：以13ml/kg剂量喂食表达PAcA/CTB嵌合蛋白的转基因番茄汁（含目的蛋白99.06μg）。B组包含三个剂量组：B1组：以7ml/kg剂量喂食表达PAcP/CTB嵌合蛋白的转基因番茄汁（含目的蛋白65.62μg）；B2组：以10ml/kg剂量喂食表达PAcP/CTB嵌合蛋白的转基因番茄汁（含目的蛋白93.74μg）；B3组：以13ml/kg剂量喂食表达PAcP/CTB嵌合蛋白的转基因番茄汁（含目的蛋白121.87μg）。C组为阴性对照组：以10ml/kg剂量喂食非转基因番茄汁。D组为阳性对照组：喂食灭活全菌疫苗（1ml／次）,共8个组,每组4只动物。2.免疫途径：喂食免疫。3.免疫时间：每周免疫一次,连续免疫4周。4.样品采集时间：分别于首次免疫前和免疫后第1、2、3、4、5、6、7、8、10、12周采集血液、唾液样品,测量动物体质量。5.特异性抗体的检测：血清和唾液中IgG、IgA采用ELISA法检测。6.于免疫后12周处死动物,取其心、肝、脾、肺、肾行病理学检查,观察免疫后各器官组织形态结构变化。结果：①以转基因番茄植株总DNA为模板经PCR扩增、电泳后见约450bp或506bp、大小扩增条带,与阳性对照一致。②BCA法分别测得总蛋白含量为4.644mg/ml和3.456mg/ml,经SDS-PAGE电泳分离出分子量约60KD大小的蛋白条带,Western blot杂交证实该条带为嵌合蛋白PAcA/CTB或PAcP/CTB。目的蛋白的浓度分别为7.62μg/ml和9.37μg/ml,分别占总可溶性蛋白的0.16%和0.27%。③分别以不同剂量番茄汁喂食免疫动物后,大白兔血液和唾液中特异性抗体水平在免疫后1周逐渐升高,实验组和阳性对照组特异性抗体水平明显高于阴性对照组（P<0.05）；实验组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；各剂量组间比较差异不明显；④相同时间点各组大白兔体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）。⑤除阳性对照组心内膜出现炎细胞浸润现象外,实验组和阴性对照组未见明显的病理学改变结论：①本课题组培育的转基因番茄成功表达了嵌合蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB, PAcA/CTB、PAcP/CTB含量分别占番茄果实可溶性总蛋白的0.16%和0.27%。②表达外源目的蛋白的转基因番茄免疫新西兰大白兔后,能有效的诱导动物唾液和血液中特异性抗变异链球菌表面蛋白PAcA、PAcP抗体的产生,转基因番茄表达的嵌合蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB具有较好的免疫原性。

论文目录

• 1 转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的实验研究
• 1.1 英文缩略词对照表
• 1.2 中文摘要
• 1.3 英文摘要
• 1.4 前言
• 1.5 实验一:转基因番茄中外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB及外源目的蛋白的检测
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 1.6 实验二:转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 1.7 全文总结
• 1.8 参考文献
• 2 转基因植物的遗传稳定性（综述）
• 3 致谢
• 附表