硫酸乙酰肝素2-O硫酸基转移酶Hs2st的克隆与表达

论文摘要

肝素和硫酸乙酰肝素（HS）是被广泛应用于临床中的抗凝血药物多糖,同时研究发现其可能在抗癌、抗病毒具有一定的作用。医药级别的肝素从家畜肠粘膜分离得到,然而从动物组织制备的肝素存在潜在的污染隐患。因此,微生物来源的heparosan合成肝素及其衍生物成为研究热点。本文以酶法合成肝素/HS为目的,对硫酸化修饰酶硫酸乙酰肝素2-O硫酸基转移酶Hs2st进行了克隆表达、纯化及其表达条件的优化。利用RT-PCR技术,以小鼠肝脏RNA为模板,成功克隆了Hs2st基因片段,并与pMD19-T载体连接,构建了pMD19T-Hs2st克隆载体。经过PCR验证、测序比对分析,克隆片段与目标条带100%相符,同时经BioEdit软件分析发现Hs2st基因片段编码356个氨基酸,Hs2st蛋白大小约为33 kDa。在成功克隆获得Hs2st的基础上,构建了表达质粒pMAL-c2X-Hs2st,并将其转化至E. coli TB1,获得了重组菌E. coli TB1/pMAL-c2X-Hs2st。经过IPTG的诱导,实现了融合蛋白MBP-Hs2st的成功表达,经过Amylose亲和层析得到了MBP-Hs2st蛋白,UN-Scan-it ge16.1软件分析融合蛋白分子量,大小约为75 kDa,Amylose亲和层析纯化收率可达47%。为确立Hs2st的高效生产工艺,利用麦芽糖结合蛋白（MBP）与Hs2st融合性能,通过构建相应的表达质粒,在大肠杆菌方面实现了Hs2st的可溶性表达。通过对LB培养基摇瓶培养大肠杆菌pMAL-c2X-Hs2st的最佳宿主菌、诱导时机、诱导剂用量、诱导时间以及添加葡萄糖和乙醇等一系列培养条件的优化,确定了该可溶性融合蛋白MBP-Hs2st的最佳生产条件,即（1）最佳宿主菌为Ecoli TB1。（2）最佳的诱导时机是菌体对数生长中后期（OD600约为0.6）,最佳诱导剂IPTG终浓度为O.4 mmol/L。 （3）对目的蛋白MBP-Hs2st表达有最佳促进作用的葡萄糖初始质量浓度范围为0.5-1.5 g/L。（4）向LB培养基中添加少量的热休克物质乙醇可以提高MBP-Hs2st的表达,最佳浓度范围为1%-3%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 引言
• 1.2 研究背景
• 1.2.1 肝素/HS的结构和生物学功能
• 1.2.2 肝素合成前体（heparosan）
• 1.2.3 肝素/HS的生物合成
• 1.2.4 肝素前体heparosan脱乙酰化修饰
• 1.2.5 酶学方法对heparosan进行硫酸化修饰
• 1.2.6 硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶（Hs2st）
• 1.3 Heparosan硫酸化衍生物的应用
• 1.3.1 抗凝血作用
• 1.3.2 对细胞因子的作用
• 1.3.3 抗病毒作用
• 1.4 大肠杆菌表达系统
• 1.4.1 大肠杆菌表达系统的表达载体
• 1.4.2 大肠杆菌表达系统的表达方式
• 1.4.3 pMAL-c2X表达系统
• 1.5 蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略
• 1.5.1 宿主的选择
• 1.5.2 载体的选择
• 1.6 本课题研究内容与创新点
• 1.6.1 本课题研究内容
• 1.6.2 创新点
• 参考文献
• 第二章 硫酸乙酰肝素2-O硫酸基转移酶基因Hs2st的克隆及序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种和质粒
• 2.2.2 组织标本
• 2.2.3 培养基与缓冲液
• 2.2.4 实验仪器
• 2.2.5 实验试剂、工具酶及试剂盒
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 小鼠总RNA提取
• 2.3.3 总RNA浓度测定
• 2.3.4 RT-PCR扩增小鼠Hs2st cDNA
• 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
• 2.3.6 PCR产物的克隆鉴定
• 2.3.7 感受态细胞E.coli DH5α制备
• 2.3.8 目的基因的转化
• 2.3.9 阳性单菌落筛选
• 2.3.10 菌落PCR验证及送样测序
• 2.3.11 克隆质粒的提取
• 2.3.12 目的基因测序及其分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 总RNA的提取和RT-PCR扩增小鼠Hs2st
• 2.4.2 目的基因Hs2st的克隆
• 2.4.3 Hs2st的测序结果及序列分析
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶（Hs2st）基因的表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验菌株和质粒
• 3.2.2 培养基、工具酶及试剂
• 3.2.3 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 pMD19-T-Hs2st重组质粒与表达载体pMAL-c2X质粒的提取
• 3.3.2 目的基因与表达载体的双酶切
• 3.3.3 重组表达质粒pMAL-c2X-Hs2st的构建
• 3.3.4 感受态细胞的制备与转化
• 3.3.5 阳性单克隆的筛选
• 3.3.6 重组菌E.coli TB1/pMAL-c2X-Hs2st的诱导表达
• 3.3.7 表达产物SDS-PAGE分析
• 3.3.8 重组融合蛋白MBP-Hs2st的纯化
• 3.3.9 蛋白质条带分析
• 3.3.10 Bradford法测定蛋白含量
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 重组表达质粒的构建
• 3.4.2 重组表达质粒的PCR鉴定
• 3.4.3 重组表达质粒的酶切鉴定
• 3.4.4 重组蛋白的表达
• 3.4.5 SDS-PAGE鉴定Amylose树脂纯化融合蛋白MBP-Hs2st
• 3.4.6 蛋白质标准曲线
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 重组大肠杆菌生产可溶性蛋白MBP-Hs2st的培养条件优化
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 培养基和缓冲液
• 4.2.3 试剂与工具酶
• 4.2.4 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 最佳宿主菌的选择
• 4.3.2 诱导时机对MBP-Hs2st表达的影响
• 4.3.3 诱导剂用量对MBP-Hs2st表达的影响
• 4.3.4 诱导时间对蛋白表达的影响
• 4.3.5 LB培养基中添加乙醇对重组蛋白表达的影响
• 4.3.6 LB培养基中添加葡萄糖对重组蛋白表达的影响
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 最佳宿主菌的选择
• 4.4.2 诱导时机对MBP-Hs2st表达的影响
• 4.4.3 诱导剂IPTG用量对蛋白表达的影响
• 4.4.4 诱导时间对蛋白表达的影响
• 4.4.5 热休克和冷休克物质对MBP-Hs2st表达的影响
• 4.4.6 LB培养基中添加葡萄糖对MBP-Hs2st蛋白表达的影响
• 4.5 小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文的情况