细胞色素P450的原核表达及应用于内分泌干扰物双酚A的检测

论文摘要

细胞色素P450是包含一个血红素蛋白的超大家族,它被发现存在于所有的生物有机体中:从细菌、酵母、真菌、植物、动物以至于人体,这个酶引人注目的特点是能够催化广泛的有机化合物的反应,能使有害物质转变成为可溶物从体内排出。因此它在各种生物合成和生物降解中起着重要的作用。本论文对人细胞色素P4501A2、P4502C9、P4502C19、P4502D6、P4503A4五种人细胞色素P450和NADPH-细胞色素P450还原酶的在大肠杆菌中共表达,表达的蛋白质进行了初步的分离,获得膜蛋白,P450表达水平每升细胞培养物从3.8到38.7 nmol不尽相同,而还原酶的表达水平每升细胞培养物从8.37到33.9 U大小不等,并以双酚A为底物研究了它们的酶活性。利用原核表达获得CYP2C9和NADPH-细胞色素P450还原酶,利用聚丙烯酰胺固定CYP2C9酶于热裂解石墨电极表面,构建相应的生物传感器,实现了CYP2C9的直接电化学,并且研究了CYP2C9的直接电化学行为,进一步应用于其相应底物双酚A的催化氧化研究和分析检测。制备一种纳米羟基磷灰石修饰碳糊电极（Nano-HAP-CPE）,并建立了一种灵敏、简便的检测双酚A的电化学分析方法。通过循环伏安法（CV）、计时库仑法（CC）、线性性扫描法（LSV）和差分脉冲伏安法（DPV）等方法研究了BPA在Nano-HAP-CPE电极上的电化学行为,得到电化学动力学参数并优化检测条件。结果表明:Nano-HAP-CPE电极对双酚A有良好的富集作用,在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中,双酚A在0.468 V处有一个明显的氧化峰。在最佳条件下,氧化峰电流与双酚A的浓度在8.00×10-8～1.25×10-5mol/L之间呈线性关系,检出限4.50×10-8mol/L,用此方法测定了聚碳酸酯塑料瓶中双酚A的含量,回收率为96.10%～103.1%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 内分泌干扰物
• 1.1.1 内分泌干扰物特点
• 1.1.2 内分泌干扰物国际、国内研究进展
• 1.1.3 内分泌干扰物分析技术的研究
• 1.2 细胞色素P450 概述
• 1.2.1 名称由来与研究历史
• 1.2.2 细胞色素P450 作用原理
• 1.2.3 P450 种类的多样性
• 1.2.4 重要的P450 代谢酶
• 1.2.5 P450 还原酶
• 1.2.6 P450 应用前景
• 1.3 本文研究的目的及意义
• 第2章 人细胞色素P450 和NADPH-细胞色素P450 还原酶的共表达及对双酚A 的代谢研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料、试剂与设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞色素P450 和细胞色素还原酶共表达
• 2.3.2 蛋白含量的测定
• 2.3.3 P450 的紫外分光光度测量
• 2.3.4 CPR 活性测定
• 2.3.5 细胞色素 P450 催化 BPA
• 2.4 结果讨论
• 2.4.1 细胞色素P450 和P450 还原酶的共表达
• 2.4.2 细胞色素P450 代谢BPA
• 2.4.3 BPA 代谢动力学研究
• 第3章 人细胞色素P4502C9 的原核表达及应用于双酚A 的安培检测研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料、试剂与设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 蛋白质的原核表达和产物的SDS-PAGE 分析
• 3.3.2 蛋白的大量表达
• 3.3.3 细胞色素P4502C9 的直接电化学及应用于双酚A 的催化氧化研究
• 3.3.4 聚丙烯酰胺膜的制备及其电极的修饰
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 CYP2C9 蛋白的提取
• 3.4.1.1 CYP2C9重组表达蛋白的SDS-PAGE凝胶比较分析
• 3.4.1.2 蛋白表达的各部分含量
• 3.4.2 基于CYP2C9 的直接电化学及用于双酚A 的检测
• 3.4.2.1 紫外-可见光谱
• 3.4.2.2 CYP2C9 的直接电化学研究
• 3.4.2.3 聚丙烯酰胺膜内的CYP2C9 的催化还原反应
• 第4章 双酚A 在纳米羟基磷灰石修饰碳糊电极上的电化学行为研究及分析应用
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料、试剂与设备
• 4.2.2 CPE 和Nano-HAP-CPE 的制备
• 4.2.3 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Nano-HAP-CPE 的电化学行为特征
• 4.3.2 BPA 的电化学行为
• 4.3.3 实验条件的优化
• 4.3.3.1 纳米羟基磷灰石比例的选择
• 4.3.3.2 支持电解质
• 4.3.3.3 pH 值的影响
• 4.3.3.4 溶剂的选择
• 4.3.3.5 扫速的影响
• 4.3.3.6 富集电位与富集时间
• 4.4 BPA 在Nano-HAP-CPE 电极上的电化学动力学参数
• 4.4.1 电荷转移系数α
• 4.4.2 有效表面积A, 扩散系数 D 和表面吸附浓度Γs
• 4.4.3 反应级数
• 4.5 分析和应用
• 4.5.1 干扰及重现性
• 4.5.2 线性范围及检测限
• 4.5.3 实际样品的测定及加标回收实验
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录