具有抗菌活性海洋共附微生物的筛选及活性产物的研究

论文摘要

由于海洋独特的环境,其中微生物及其代谢产物已成为开发新型抗菌、抗病毒、抗肿瘤制剂和制备活菌制剂的重要来源。本研究基于此背景下,主要从海参肠道内筛选出抗菌活性高、抗菌谱广、安全的菌株,同时对抗菌物质的理化性质、产抗菌物质菌株的培养组分进行了研究,研究结果分述如下：1.利用琼脂块法初筛得到抗菌活性的菌株。从135个菌株中筛选得到26株具抗菌活性的菌株,占到筛选总数的19.20%。经过复筛后,最终得到16株具有显著抑菌活性的菌株,其中有6株菌只对弧菌有较强抑制作用,有7株菌只对溶壁有较强抑制作用,有3株菌对弧菌和溶壁均有较强抑制作用。最终选取一株具有广谱抗菌活性的菌株（命名为HS-A38）进行下一步的研究。2.对菌株HS-A38的代谢产物中的活性成分理化性质进行了研究。活性粗提物经过不同的温度、酸碱和有机溶剂的处理,采用牛津杯法测抑菌活性,结果发现：该活性物质耐高温强,经121℃处理仍有活性；该活性物质pH耐受性范围广,在pH 2-12之间仍然具有活性；该活性物质在常见有机溶剂中能保持活性,并且在甲醇中耐受性最佳。3.菌株HS-A38发酵液经过盐酸沉淀,有机溶剂萃取,甲醇溶解后点样于薄层层析板,再经过茚三酮显色,并结合生物自显影技术,发现4种物质：初步推断为直链类的脂肽化合物,并且初步分析得到化合物1和2具有抑制副溶血弧菌的能力。4.优化了菌株HS-A38的培养基组成。通过单因素实验和响应面实验设计得到最佳的培养基组分为：葡萄糖8.49 g/L,豆粕粉12.0g/L,尿素0.625 g/L,酵母膏4.0g/L,K2HPO4 4.0 g/L, ZnSO4 0.053 g/L,优化后的活菌浓度达到1.64×109cfu/mL,与优化前菌体浓度7.22×108相比,提高了2倍多。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 海洋共附微生物的研究现状
• 1.2.1 海洋共附微生物宿主及种类
• 1.2.2 海洋共附微生物与宿主的关系
• 1.2.3 共附微生物的拮抗作用机理
• 1.2.4 共附微生物产生的活性物质
• 1.3 具抗菌活性的微生物的筛选策略
• 1.3.1 宿主的选择
• 1.3.2 培养基的选择
• 1.3.3 筛选方法
• 1.4 芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展
• 1.4.1 芽孢杆菌作为益生菌的优势
• 1.4.2 芽孢杆菌在水产养殖方面的应用
• 1.4.3 芽孢杆菌产生的抗菌物质
• 1.4.5 芽孢杆菌产抗菌活性物质的分离提取
• 1.4.6 脂肽类活性物质的生化检测
• 1.5 微生物发酵增殖培养基的优化策略
• 1.5.1 单因素实验
• 1.5.2 多因素实验
• 1.6 研究的目的与意义
• 1.7 本实验的设计思路
• 第二章 海参肠道具抗菌活性微生物的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 宿主来源
• 2.2.2 指示菌
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 试剂
• 2.2.5 仪器
• 2.2.6 辅助器材
• 2.3 方法
• 2.3.1 分离平板培养基的制备
• 2.3.2 菌株分离与富集培养
• 2.3.3 琼脂块法初筛
• 2.3.4 菌种纯化
• 2.3.5 菌种保藏
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 不同分离培养基的菌株生长情况
• 2.4.2 指示菌平板最适浓度
• 2.4.3 琼脂块初筛结果
• 2.4.4 纯化及保藏结果
• 2.5 小结
• 第三章 海参肠道菌HS-A38抗菌活性物质性质研究与初步检测
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 供试菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 仪器
• 3.2.5 辅助器材
• 3.3 方法
• 3.3.1 菌株HS-A38发酵上清液制备
• 3.3.2 菌株HS-A38发酵上清液抗菌谱测定
• 3.3.3 菌株HS-A38发酵上清液活性物质的研究
• 3.3.4 菌株HS-A38发酵上清液活性物质的粗提
• 3.3.5 菌株HS-A38抗菌粗品的茚三酮和生物自显影分析
• 3.3.6 化合物1和2的分离及活性检测
• 3.3.7 脂肽类物质温度耐受性的检测
• 3.3.8 脂肽类产物发酵代谢时期的测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 菌株HS-A38生长曲线
• 3.4.2 菌株HS-A38发酵上清液的抑菌谱
• 3.4.3 菌株HS-A38发酵上清液活性物质的性质
• 3.4.4 茚三酮染色和生物自显影分析
• 3.4.5 化合物1和2的分离及活性检测
• 3.4.6 脂肽类物质温度耐受性的影响
• 3.4.7 脂肽类物质发酵代谢时期分析
• 3.5 小结
• 第四章 菌株HS-A38发酵培养基的优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 仪器及辅助器材
• 4.3 方法
• 4.3.1 菌种活化与培养
• 4.3.2 活菌计数
• 4.3.3 活菌浓度测定
• 4.3.4 单因素实验
• 4.3.5 响应面优化
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 单因素实验
• 4.4.2 单因素实验小结
• 4.4.3 响应面实验优化结果
• 4.4.4 响应面实验小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢