木聚糖酶的酶学特性及基因克隆表达研究

论文摘要

木聚糖（Xylan）是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文主要对黑曲霉产木聚糖酶进行了如下研究：1．黑曲霉培养基的优化。通过单因素试验及正交试验确定了黑曲霉液体发酵产木聚糖酶最适的发酵培养条件为：麸皮80g／L，酵母膏15g／L，Tween80 2g／L，无机盐K2HPO4为2．6％，CaCl2为0．5％，MgSO4．7H2O为1％，FeSO4．7H2O为0．016％，装液量为50ml／250 ml，培养的起始pH为5．0，培养温度为28℃，培养时间为72 h，摇床的转速为150r／min，在此条件下，菌株产木聚糖酶活性较高，能提高至酶活为85．3U／ml。2．用双水相法提纯木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提纯，确定最佳的纯化条件为：PEG4000浓度为19％（w／w）、磷酸氢二钾浓度为10％（w／w）、氯化钠浓度为0（w／w）。在此条件下，木聚糖酶的提取效果较好，K和Yt的值分别为29．34和88．67％。3．木聚糖酶酶学性质的研究。本论文对黑曲霉产木聚糖酶的酶学性质进行了研究，结果表明：该木聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH为5．0，在酸性的条件pH3．0～6．0的范围内稳定性较好，是典型的酸性木聚糖酶；在40～50℃间的热稳定性较好。在金属离子中，Fe2+、Mg2+、Zn2+对木聚糖酶的酶活有不同程度的促进作用；Al3+对木聚糖酶稍有影响使其活力降低；而其余的大部分金属离子对酶的活性的影响并不大，并没有发现对酶有着明显激活或抑制作用的离子。4．本论文以黑曲霉菌株基因组DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增出得到一条大小约为750bp和680bp的片段，测序结果表明该DNA基因全长746bp，含有68bp的内含子，基因编码区长678bp，目前，该基因已提交Gen Bank，登录号为EU423881。。将测序所得正确的xynB结构基因与酵母分泌型表达载体pPIC9K进行连接，转化大肠杆菌DH-5α，构建表达载体pPIC9K—xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母（Pichia pastorisGS115），经MM／MD快慢斑进行筛选，并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培养，4～6天后，将其点于RBB-木聚糖平板上，可见产生了明显的透明圈。工程菌SMD-xynB-2木聚糖酶产量达到216U／ml，比原出发菌株提高了2．53倍，表达产物具有生物学活性，分泌到细胞外，可溶且木聚糖酶的表达具有良好的遗传稳定性。重组木聚糖酶的酶学性质与原始木聚糖酶基本相同，分别为最佳反应温度为50℃，最适pH约为5．0，热稳定性和原菌株相比，在40℃～70℃时变化不明显，80℃比原菌株下降0．2％。探索了不同碳源、不同氮源及甲醇的添加量对重组酵母产木聚糖酶的影响，结果表明：最佳的碳源为麸皮，最佳的氮源为牛肉膏，甲醇的添加量为0．5％诱导效果最好。SDS-PAGE电泳表明，重组酵母产木聚糖酶的分子量约为24KD。5．以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体，研究了不同培养基、不同激素种类和配比对胚性愈伤组织诱导的影响，以及不同分化培养基对胚状体分化的影响。结果表明：下胚轴外植体胚性愈伤组织诱导率最高；最佳胚性愈伤组织诱导培养基为改良SH+2．0mg／L2．4-D+0．5 mg／L6-BA；最佳胚状体诱导培养基为MSO+2．0 mg／L6-BA+0．5mg／LNAA；成苗培养基为1／2MS+1％蔗糖+0．7％琼脂。构建了PBI121-xynB表达载体，经酶切鉴定，构建成功，并转化苜蓿，但转化率低，提取叶片测得酶活为10．5U／g。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一篇 木聚糖酶的研究现状
• 1.木聚糖和木聚糖酶分类
• 1.1 木聚糖的结构
• 1.2 木聚糖酶的分类
• 2 木聚糖酶的理化性质
• 2.1 木聚糖酶的热稳定性
• 2.2 木聚糖酶的酸碱稳定性
• 2.3 木聚糖酶的分子结构
• 2.4 木聚糖酶的催化机制
• 3.木聚糖酶的分子生物学
• 3.1 木聚糖酶基因的原核表达系统
• 3.2 木聚糖酶基因的真核表达系统
• 3.3 木聚糖酶基因在植物中的表达研究
• 4.木聚糖酶的纯化
• 5.木聚糖酶的应用
• 5.1 木聚糖酶在饲料工业中的应用
• 5.2 木聚糖酶在造纸工业中的应用
• 5.3 木聚糖酶在食品中的应用
• 5.4 木聚糖酶在医药工业中的应用
• 5.5 木聚糖酶在其它方面的应用
• 6.存在的问题与展望
• 7.本研究的目的与意义
• 第二篇 研究内容
• 第一章 黑曲霉发酵产木聚糖酶培养条件的优化
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 实验结果与分析
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 木聚糖酶的初步纯化及其酶学性质研究
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.3 实验结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 黑曲霉木聚糖酶基因（XYNB）的扩增及在毕赤酵母中的表达
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 农杆菌介导的XYNB基因转化苜蓿的初步研究
• 4.1 试验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3.结果与分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 总结
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢
• 作者简介