分泌性表达人rPA毕赤酵母菌株的构建及发酵条件的优化

论文摘要

血栓病是人类面临的一类主要疾病,包括急性心肌梗塞、脑血栓、肺静脉血栓、动脉血栓和缺血性休克等。其中急性心肌梗塞（AMI）的死亡率高达30%。溶纤治疗被认为是治疗血栓病最为有效的方法。寻找、研制效果好、副作用小的治疗药物一直是世界范围的热门课题。其中占中心地位的是纤溶酶原激活剂（plasminogen activator简称PA）,PA作为溶血栓药物的机理在于它能激活血纤溶酶原（plasminogen简称Pg）成为血纤溶酶（plasmin）,后者能够降解构成血栓骨架的血纤蛋白（fibrin）,从而消除血栓。所谓溶纤能力包括了药物溶解血栓的速率、彻底性和再栓塞发生率等方面。一个好的溶纤剂能够溶解陈旧或新鲜的血栓,再栓塞率低。国内、外进入临床应用和正在研制的溶纤药物基本分为三代:第一代溶栓剂包括链激酶（SK）和尿激酶（UK）,它们虽然具有较好的溶栓效果,但缺少纤维蛋白的选择性,除了能激活血栓表面的纤溶酶原外也能激活血浆中游离的纤溶酶原。使α2-抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解,引起全身出血性副作用。第二代溶栓剂包括组织纤溶酶原激活剂（t-PA）,尿激酶原（Pro-UK）等。t-PA和Pro-UK在体外和动物实验中都有明显的纤维蛋白亲和性,出血性副作用较小,体外无溶栓活性,进入血液后,与纤维蛋白结合后发生脱酰基水解反应,形成有活性的SK-纤溶酶原复合物,激活纤溶酶原。但存在体内半衰期短,给药时间长,再栓率高等缺点。第三代溶栓药物包括TNK-PA,STAR,rPA等以及正在研制的一些新型溶栓剂。它们基本具备以下特点:溶栓能力强,出血性副作用低,在血液中的半衰期长,总使用剂量少,治疗费用低等。第一代溶栓药物具有自身难以克服的缺陷,如出血、副作用大等,已被淘汰。第二代溶栓剂已有所改进,但还不理想。目前国际上正在致力于用蛋白质工程手段开发第三代溶栓剂。研究方向是在增强或保持其催化活性前提下,通过对某些特定氨基酸残基的突变或是通过相关结构域的删除、增加或融合等手段,达到以下目标:1. 提高对纤维蛋白的选择性;2. 提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性;3. 延长其在血液循环中的半衰期;4. 增强其溶栓能力。rPA是由t-PA经基因工山东大学硕士论文程改造的缺失突变体,仅包括t一PA的Kringle一2和蛋白酶区,其主要优点是延长了体内半衰期,减少了血液清除率,降低了出血性等副作用。被公认为是安全、有效的溶栓药物。目前国内尚没有:PA上市,而国外上市的:队是通过大肠杆菌表达系统获得,表达产物含355个氨基酸的非糖基化单链分子,分子量约39kD,含9对二硫键,多以包涵体形式存在,产品提取和纯化过程需经过复杂的变、复性条件,多二硫键极易形成错配和不稳定,纯化过程回收率往往低于表达量的10%。此外大肠杆菌细胞壁脂多糖是药品内毒素的主要来源,r队单剂用量通常又是其它重组蛋白如thG一CSF,取Fa一Zb单剂用量的30倍以上,因而产品要求纯度高,内毒素含量低,这无疑又加大了下游纯化工艺的难度,增加药物成本。为克服上述缺点,寻求新的表达系统是急需解决的问题之一。巴氏毕赤酵母（P ichia pastoris）是一种甲醇酵母,其细胞过氧化物酶中含甲醇代谢途径必需的醇氧化酶。AQ石为强诱导启动子,受甲醇诱导,易于调控外源基因表达,并且表达效率高。巴氏毕赤酵母（尸l’chiapastoris）作为真核生物,能对外源真核生物基因表达产物进行正确翻译和翻译后加工。甲醇营养型酵母与分泌型酵母表达质粒整合重组,已成功分泌表达许多外源蛋白。本文通过PCR扩增得到（rPA）基因片断,将该基因片断插入到含有AOXI启动子和a分泌性信号肤序列载体pPICgK中,构建了重组表达质粒 pPIcg众PA,转化Pichia pastoris GSlls宿主菌。通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况,筛选His+Mut,表型转化子。并在2.omg/m L G418平板上筛选得到多拷贝转化子GRIO,GRll。摇瓶培养,甲醇诱导表达,表达产物经SDS一PAGE和研触stemblot分析,结果表明重组蛋白分子量约39kD,能与特异性单克隆抗体发生免疫反应;采用场（34）正交试验优化发酵条件,体外气泡法测定:PA活性,结果显示重组蛋白具有较好纤溶活性。最高表达活性达10501U/mL。我们用毕赤酵母（Pichiapastoris）表达体系成功地表达了rPA,为进一步研究多二硫键重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达提供了一些参考。关键词:组织型纤溶酶原激活剂突变体:毕赤酵母;分泌表达:发酵条件

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ABSTRACT

本文缩写词表

1.绪论

1.1溶栓药物的研究现状

1.2国内、外研究开发Reteplase现状

1.3Reteplase的结构与功能及动物和临床实验

1.3.1Reteplase的分子结构

1.3.2体外Reteplase的功能

1.3.3动物模型中的试验

1.4t-PA与Reteplase临床药效学差异

1.5巴斯德毕赤酵母表达系统

1.5.1概述

1.5.2酵母表达宿主菌

1.5.3毕赤酵母表达载体

1.5.4影响外源基因在毕赤酵母中表达的重要因素

1.5.4.1外源基因特性

1.5.4.2表达框的染色体整合位点和方式

1.5.4.3基因剂量

1.5.4.4分泌信号

1.5.4.5产物稳定性

1.5.4.6表达产物的翻译后修饰

1.6毕赤酵母表达系统与大肠杆菌包涵体表达系统表达Reteplase比较分析

1.7本论文的研究工作

2.材料与方法

2.1菌种与质粒

2.2试剂与酶类

2.2.1试剂

2.2.2酶类

2.3培养基

2.4微生物学技术

2.4.1菌体的生长

2.4.2菌种的保存

2.5分子生物学方法

2.5.1大肠杆菌质粒的提取

2.5.2琼脂糖凝胶中DNA片断的回收

2.5.3DNA纯度和浓度的测定

2.5.4琼脂糖凝胶电泳

2.5.5限制性内切酶

2.5.6大肠杆菌转化

2.5.7PCR反应

2.5.8DNA序列测定

2.5.9pPIC9K／rPA质粒的构建

2.5.10毕赤酵母细胞的转化

2.5.11阳性转化子的筛选

2.5.12阳性转化子的鉴定

2.5.13阳性转化子多拷贝筛选

2.5.14发酵条件的优化

2.5.15表达产物SDS-PAGE电泳检测

2.5.15.1试剂配制

2.5.15.2操作步骤

2.5.16表达产物Western blot鉴定

2.5.17表达产物生物学活性测定

3.结果

3.1目的基因的PCR扩增及鉴定

3.2pGEM-T／rPA测序载体的构建和鉴定

3.3pGEM-T／rPA序列分析

3.4pGEM-T／rPA质粒的构建和鉴定

3.5表达菌株的构建和筛选

3.6多拷贝转化子的筛选

3.7表达产物的鉴定

3.7.1SDS-PAGE鉴定

3.7.2Western blot鉴定

3.8生物学活性检测

3.9发酵条件的优化

4.讨论

全文总结

参考文献

致谢

分泌性表达人rPA毕赤酵母菌株的构建及发酵条件的优化

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