肝细胞癌中肿瘤抑制基因XAF1表达调控机制的实验研究

论文摘要

第一部分肝细胞癌中XAF1表达及其临床意义的研究目的凋亡抵抗在人类肿瘤的发生和发展中起重要的作用。凋亡抵抗与促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子的调控失衡有关。凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族就是一类重要的抗细胞凋亡因子。已有研究发现肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）存在IAPs高表达。X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（X-linkedinhibitor of apoptosis protein associated factor-1，XAF1）是一个新发现的拮抗IAP的因子。已有研究表明XAF1在胚胎组织及成人正常组织中广泛表达，但是在肿瘤细胞株和肿瘤组织中低表达甚至不表达，是一个潜在的抑癌基因。本部分通过检测XAF1mRNA和蛋白在HCC中表达水平，探讨XAF1在HCC发生中的作用。方法应用RT-PCR技术检测人胎肝细胞株L02、人肝癌细胞株SMMC7721、HepG2、Hep3B和30例肝癌及其相应癌旁组织XAF1 mRNA的水平，同时应用免疫组织化学方法检测上述细胞株及组织中XAF1蛋白的表达，并分析与临床病理指标之间的关系。结果人胎肝细胞株L02检测到XAF1 mRNA和蛋白的表达，人肝癌细胞株SMMC7721和HepG2、Hep3B中XAF1 mRNA和蛋白的表达低。肝癌组织XAF1 mRNA和蛋白表达较癌旁组织显著降低（mRNA：t=2．392，P=0．000；protein：t=17．57，P=0．000）。免疫组化染色显示，XAF1蛋白表达分布在肝细胞胞质和胞核中，低分化的肝癌组织XAF1的表达下降显著低于中、高分化肝癌组织。结论XAF1 mRNA及蛋白在肝癌组织及肝癌细胞系中表达水平降低，XAF1转录抑制可能是促进肝细胞癌发生的一个重要因素。第二部分肝癌细胞株中XAF1启动子的甲基化与化疗耐药的关系目的启动子的甲基化是肿瘤抑制基因失活的主要机制之一，基因的异常甲基化能改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。目前肝癌的化疗效果差强人意。本部分的研究将探讨肝癌细胞株中XAF1启动子异常甲基化和其化疗耐药的关系。方法甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）检测肝癌细胞株XAF1启动子甲基化情况。去甲基化药物5-Aza-CdR作用肝癌细胞株后是否逆转XAF1的甲基化。在肝癌细胞株外源性导入XAF1，MTT检测XAF1是否影响化疗药物对肝癌细胞株的生长抑制，流式细胞仪检测XAF1是否影响化疗药物诱导肝癌细胞株凋亡，Western Blot检测活化的caspase-3及底物PARP的表达。结果MSP分析显示肝癌细胞株存在XAF1启动子异常甲基化，5、10μmol／L5-Aza-CdR作用肝癌细胞株后，XAF1mRNA显著增加（P值分别为0．034、0．002）。XAF1能显著增加化疗药物对肝癌细胞的生长抑制，细胞凋亡作用。另XAF1能通过增加caspase-3的活化途径而增强肝癌细胞株的化疗敏感性。结论XAF1启动子的异常甲基化导致XAF1转录抑制，过表达的XAF1能够增加化疗药物的敏感性，诱导肝癌细胞凋亡。XAF1启动子的异常甲基化导致XAF1转录抑制可能是肝癌细胞株化疗耐药的分子事件之一，同时我们的研究为去甲基化药物在肝癌联合治疗的应用提供了实验依据。第三部分肝细胞癌中HSF1负性调控XAF1转录水平的机制研究目的应激因素包括：高温、重金属、炎症、自身免疫性反应和病毒感染等。有些应激因素已被认为是致瘤因素。在各种应激反应下热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）能通过调节热休克家族蛋白，保护真核细胞在这些不利环境下存活。最近有研究表明HSF1还通过结合某些基因的热休克结合元件（heat shock element，HSE）而调控其转录水平。而我们发现XAF1的启动子区域存在HSE顺式作用元件。前面研究显示在肝癌细胞株和肝癌组织中XAF1的表达下降，XAF1启动子的异常甲基化是XAF1转录抑制的机制之一。这部分研究中，我们通过经典的热应激细胞模型研究肝细胞癌中HSF1与XAF1转录抑制关系。方法从肝癌细胞株中扩增XAF1基因的含HSE启动区域片段并克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic，并命名为pGL3-XAF1p。pGL3-XAF1p转染细胞后通过荧光素酶活性测定检测XAF1启动子活性。设计2对针对HSF1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hH1neo-HSF1。并筛选出最具沉默效应的psiRNA。制备经典的热应激细胞模型，诱导肝癌细胞发生热休克反应。一方面，HepG2细胞经过热应激处理后，检测热休克反应下肝癌细胞HSF1和XAF1 mRNA和蛋白的表达改变。另一方面，psiRNA转染HepG2靶向抑制HSF1后，转染的细胞经过热应激处理后，检测HSF1基因沉默后对XAF1表达的影响。pGL3-XAF1p转染HepG2后，转染的细胞经过热应激处理后，经过双荧光素酶报告基因系统检测XAF1启动子的活性。免疫组织化学技术检测HSF1在30例肝癌组织及癌旁组织的表达，并统计分析其与XAF1表达的相关性。结果重组质粒pGL3-XAF1p，psiRNA1，psiRNA2，及psiRNA3经过酶切和测序检测其正确性。psiRNA2靶向沉默HSF1效率最强。热休克反应下肝癌细胞株中HSF1的表达上调和XAF1的表达下调。psiRNA2靶向沉默HSF1后，热休克反应下的HepG2细胞中XAF1表达上调。双荧光素酶报告基因系统检测显示：热休克反应下HepG2细胞XAF1启动子的活性显著降低。免疫组织化学法结果显示肝癌组织中HSF1的表达与XAF1负相关。结论HSF1通过结合XAF1启动子区域的HSE能下调XAF1的表达，是XAF1在肝癌中转录抑制的机制之一。第四部分Triptolide通过上调XAF1表达促进热应激下肝癌细胞株凋亡目的雷公藤内酯醇（Triptolide，TPL）是雷公藤中分离到的二萜内酯化合物，作为纯天然药物在我国已应用数百年。临床上主要是用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病。如类风湿性关节炎。近年来的研究发现在体外实验中TPL能抑制肿瘤细胞的生长，在体内实验TPL能抑制裸鼠移植瘤的生长和转移。最近有研究表明TPL能够抑制HSF1蛋白的活性。而在我们第三部分的研究结果显示HSF1负性调控XAF1表达。所以在本部分的研究中，通过经典的热应激细胞模型，探讨TPL是否通过影响XAF1表达而促进热应激下肝癌细胞凋亡。方法肝癌细胞系HepG2加入不同浓度的TPL培养后接着给予热应激处理，运用MTT法测定肝癌细胞系的存活率，运用流式细胞仪检测细胞凋亡率，运用Western Blot检测肝癌细胞HSF1和XAF1的蛋白表达变化。此外，转染pGL3-XAF1p的HepG2在TPL作用后，随后热应激处理，双荧光素酶报告基因系统测定法检测HepG2细胞XAF1启动子活性的改变。过表达XAF1的肝癌细胞在热应激处理后，检测肝癌细胞凋亡的情况。结果TPL能够抑制热应激HepG2的生长，且有浓度依赖性。TPL能够诱导热应激肝癌细胞系的凋亡，且XAF1mRNA和蛋白的表达增加。双荧光素酶报告基因系统测定法检测显示TPL能够显著提高XAF1启动子活性。过表达的XAF1能够显著诱导热应激的肝癌细胞凋亡。结论HSF1负性调控XAF1是肝癌细胞在应激反应下自我细胞保护作用的分子事件之一。TPL引起热应激下肝癌细胞系凋亡，其机制是通过上调XAF1转录活性。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 肝细胞癌中XAF1表达及其临床意义的研究
• 1.材料及方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二部分 肝癌细胞株中XAF1启动子的甲基化与化疗耐药的关系
• 1.材料及方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第三部分 肝细胞癌中HSF1负性调控XAF1转录水平的机制研究
• 1.材料及方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第四部分 Triptolide通过上调XAF1表达促进热应激下肝癌细胞株凋亡
• 1.材料与方法
• 2.实验结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录1:实验中所使用的主要仪器和配置的试剂
• 附录2:攻读期间发表的论文
• 致谢