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白眉蝮蛇新磷脂酶A2同源物的研究

2020-11-23阅读(630)

白眉蝮蛇新磷脂酶A2同源物的研究

论文摘要

长白山白眉蝮蛇（Agkisttvdon blomhoffii ussurensis）属于蝰蛇科蝮蛇亚科白眉蝮乌苏里亚种,俗名目本本蝮蛇（Manushi）,主要分布于我国东北部、朝鲜及俄罗斯的部分地区;蛇毒中的磷脂酶A2同源物（phospholipaseA2,PLA2）除了酶活性外,具有多种生物学活性,是蛋白质结构与功能研究的理想天然蛋白。 本研究以小白鼠的腹腔注射给药,无出血致死作为检测指标,采用Hitrap SP阳离子交换、Superdex 75凝胶过滤层析、Source Q阴离子交换层析三步纯化方法,从长白山白眉蝮蛇蛇毒中纯化神经毒素,得率是3.25%;同时建立的抗毒素特异性IgY配基一步亲和层析纯化神经毒素,得率可达12.9%,是三步纯化方法的4倍。该蛋白质经变性聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）检测为一条带,与凝胶过滤测定的分子量相符,是单链多肽;质谱检测分子量为13881.854±0.33 Da;等电聚焦测定等电点约为8.56。 通过对分离白眉蝮蛇神经毒素进行的氨基酸组成分析,N-端氨基酸测定,肽质谱指纹图谱分析,结合cDNA序列测定,确定了该毒素的一级结构,具有典型的第二类磷脂酶A2结构特征,第49位是Gln,是PLA2数据库中一个新的磷脂酶A2同源物,命名为Gln49-PLA2,它含有122个氨基酸残基,14个Cys,可能形成7对二硫键,与Asp49-PLA2s的同源性（93%-61%）高于Lys49-PLA2s（60%-56%）,进化树分析结果表明,Gln49-PLA2和Asp49-PLA2s的亲缘关系要近于Lys49-PLA2s。 Gln49-PLA2的体外卵磷脂为底物的PLA2酶活性检测、红细胞的直接和间接溶血活性检测、寓含血小板血浆的抗凝血活性检测,大肠杆菌的抑菌实验,结果表明该蛋白质没有PLA2活性、溶血活性、抑菌活性,但具有抗凝血作用,浓度高于0.2mg/ml时,随物浓度的增加,复钙时间显著延长;氨基酸序列分析和三级结构模拟结果表明一级结构氨基酸残基序列的变化,特别是49位Gln残基取代Asp是PLA2水解活性丧失的主要原因,同时证明抗凝血活性位点与水解活性位点相互独立。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 1 蛇毒的研究进展
  • 1.1 概述
  • 1.2 蛇毒的成分及毒理作用
  • 1.2.1 有机小分子化合物
  • 1.2.2 酶类
  • 1.2.3 蛇毒中的毒素及其活性因子
  • 2的研究'>1.3 蛇毒磷脂酶A2的研究
  • 2的分类'>1.3.1 PLA2的分类
  • 2的结构特征'>1.3.2 蛇毒磷脂酶A2的结构特征
  • 2的催化机理'>1.3.3 PLA2的催化机理
  • 2的功能'>1.3.4 蛇毒PLA2的功能
  • 2的药理作用机制'>1.3.5 PLA2的药理作用机制
  • 1.4 本研究的选题依据和研究内容
  • 参考文献
  • 2 白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的筛选及纯化
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 长白山白眉蝮蛇神经毒素的分离纯化
  • 2.3.2 蛋白质定量分析
  • 2.3.3 蛋白质分子量测定
  • 2.3.4 蛋白质等电点测定
  • 2.3.5 蛋白质毒性测定
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 蛇毒神经毒素的筛选及纯化
  • 2.4.2 白眉蝮蛇神经毒素的电泳检测
  • 2.4.3 白眉蝮蛇神经毒素的质谱检测
  • 2.5 小结
  • 参考文献
  • 3 白眉蝮蛇神经毒素的结构分析
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 氨基酸组成分析
  • 3.3.2 N末端序列分析
  • 3.3.3 肽谱分析
  • 3.3.4 基因克隆及cDNA序列分析
  • 2的三级结构模拟'>3.3.5 Gln49-PLA2的三级结构模拟
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 氨基酸组成分析
  • 3.4.2 N末端序列分析
  • 3.4.3 肽谱序列分析
  • 3.4.4 cDNA序列分析
  • 2的空间结构分析'>3.4.5 Gln49-PLA2的空间结构分析
  • 3.5 小结
  • 参考文献
  • 2同源物的生物活性分析'>4 白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物的生物活性分析
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料
  • 4.3 实验方法
  • 2同源物的制备'>4.3.1 长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物的制备
  • 4.3.2 蛋白质含量的测定
  • 2酶活性测定'>4.3.3 PLA2酶活性测定
  • 4.3.4 抗凝血活性测定
  • 4.3.5 溶血活性测定
  • 4.3.6 抑菌活性的测定
  • 4.3.7 神经毒性鉴定及止痛活性分析
  • 4.3.8 肌肉毒性分析
  • 4.3.9 细胞毒性分析
  • 4.4 结果与讨论
  • 2的活性'>4.4.1 PLA2的活性
  • 4.4.2 抗凝血活性
  • 4.4.3 溶血活性
  • 4.4.4 抑菌活性
  • 4.4.5 神经毒性及止痛活性
  • 4.4.6 肌肉毒性分析
  • 4.4.7 细胞毒性分析
  • 4.5 小结
  • 参考文献
  • 5 结论与展望
  • 5.1 主要研究成果和结论
  • 5.2 前景与展望
  • 论文创新点
  • 作者在读期间论文发表情况
  • 致谢
  • 附录
  • 肽指纹质谱图1
  • 肽指纹质谱图2
  • 肽指纹质谱图3
  • 肽指纹质谱图4
  • 肽指纹质谱图5
  • 肽指纹质谱图6
  • 肽指纹质谱图7
  • 肽指纹质谱图8
  • 肽指纹质谱图9
  • N端氨基酸测序图谱

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