二恶英生物检测体系相关蛋白质的表达

论文摘要

为建立二恶英生物检测体系,本课题在分析与研究AhR与ARNT两个蛋白质特征的基础上,克隆表达出AhR与ARNT两个全长蛋白及AhR的两个特征性多肽片段,并用后者免疫动物制备多克隆抗体。这些蛋白与抗体为检测体系的建立及相关研究奠定了重要的基础。 本研究以从C57BL/6J纯系小鼠肝组织中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增目的基因,通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析验证扩增产物的正确性后,将其定向克隆入pGEX-5X-1表达质粒中,构建了AhR和ARNT全长及片段AhR-PAS、AhR-C、ARNT-PAS共五个蛋白的pGEX-5X-1-融合蛋白重组表达质粒。将酶切鉴定结果正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞中,通过诱导前后的SDS-PAGE分析,筛选出目的蛋白表达阳性的细菌克隆,通过划板或冻存菌液的方式保存好菌种。 然后,针对用于制备AhR多克隆抗体的两个片段蛋白AhR-PAS和AhR-C进行蛋白表达诱导条件的优化和大量提纯。通过对表达蛋白的细胞内定位分析,发现表达产物AhR-C大部分为存在于胞质中的可溶性蛋白,而AhR-PAS的表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中,且通过优化诱导条件无法使其以可溶性蛋白的形式表达。鉴于此,我们分别采取了Glutathione SepharoseTM 4B珠子亲和吸附与包涵体纯化的方法来提纯这两个片段蛋白的表达产物。然后利用收获的融合蛋白,采用2002年Cell Research介绍的一种快速制备多克隆抗体的新方法免疫新西兰大白兔制备AhR的特异性抗体。

论文目录

• 名词缩写解释
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景与课题的学术思想
• 1 二恶英的毒性效应与污染概况
• 2 二恶英类化学物质的检测方法
• 3 本课题的基本思想
• 第二章 实验部分
• 1 实验器材
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 缓冲液及贮存液
• 2.1 总RNA的抽提及质量鉴定
• 2.2 分子克隆
• 2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 细菌培养
• 2.5 融合蛋白的表达与可溶性蛋白的纯化
• 2.6 包涵体的制备、洗涤和纯化
• 2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3 实验方法
• 3.1 组织中总RNA的抽提及质量鉴定
• 3.2 RT-PCR扩增目的基因
• 3.3 含外源目的基因表达质粒的构建
• 3.4 融合蛋白的诱导表达与纯化
• 3.5 多克隆免疫血清的制备
• 3.6 其他常规实验方法
• 第三章 实验结果与讨论
• 1 肝脏组织中总RNA的提取与引物设计
• 1.1 实验动物与组织的选择
• 1.2 抽提总RNA后的鉴定结果
• 1.3 AhR的序列分析与特征片段的选择
• 1.4 ARNT的序列分析
• 1.5 引物设计
• 2 RT-PCR及重组质粒的构建
• 2.1 RT-PCR扩增目的基因
• 2.2 构建融合蛋白重组表达质粒
• 3 融合蛋白的表达与目的蛋白的纯化
• 3.1 融合蛋白的表达及鉴定
• 3.2 片段蛋白AhR-PAS、AhR-C表达的细胞内定位分析及纯化
• 4 多克隆抗血清的制备
• 4.1 实验动物的选择
• 4.2 免疫方案
• 4.3 进一步的研究方向
• 小结
• 参考文献
• 研究生学习期间参与其它课题研究情况
• 论文发表情况
• 致谢