胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物基因组全序列及编码的P3蛋白与寄主互作的初步研究

论文摘要

在陕西洋葱上发现了一种引起畸形黄条症状的病害,采用马铃薯Y病毒科简并引物结合基因特异引物的方法,扩增并测定了侵染陕西洋葱的病毒基因组cDNA全序列。该病毒基因组全序列由10 427个核苷酸组成,具有单一开读筐,编码一个由3 340个氨基酸组成的分子量379.7kD的多聚蛋白。序列分析表明该病毒与SYSV-ZQ2分离物同源性最高,核苷酸同源性为93.2%,多聚蛋白的同源性为97.5%,根据马铃薯Y病毒科病毒的分类标准,我们在陕西洋葱上发现的病毒为SYSV的一个分离物,命名为为SYSV-O。蛋白裂解位点分析发现,除NIb-CP裂解位点外,SYSV洋葱分离物O与大葱分离物ZQ2的裂解位点完全一致,该位点序列前者为VSYQ/A,而后者为VSYQ/V。编码的各蛋白均具有Potyvirus属成员特征性的保守基序和活性位点。SYSV-O的外壳蛋白蚜传保守基序DAG被DAA替换。与OYDV相似,SYSV也编码独特的大P3蛋白,但P3蛋白功能至今尚不清楚。SYSV-O与SYSV-ZQ2编码的6K1蛋白氨基酸序列完全相同,NIa-Pro、HC-Pro、P3和6K2蛋白也较保守,而NIa-VPg蛋白差异较大,氨基酸序列同源率为93.6%。SYSV-O与其它SYSV分离物CP基因的核苷酸序列同源率为87.3%84.1%,编码的蛋白氨基酸序列同源率为89.2%-98.4%。对SYSV分离物基因组3’-末端部分核苷酸序列的系统进化树分析表明,SYSV分离物形成4个明显的群体。其中印度尼西亚胡葱分离物成簇为一个群体,日本大葱、薤、分葱分离物和一个印度尼西亚大葱分离物成簇为一个群体,中国杭州分葱分离物和中国章丘大葱分离物（ZQ2）成簇为一个群体,中国杭州大葱分离物、章丘大葱分离物（ZQ1）和陕西洋葱分离物成簇为一个群体。分离物间的进化相关性与其寄主植物及地理分布有关。构建了酵母双杂交载体pGBKT7-（SYSV-O） P3,并成功转入酵母菌AH109。Western blot分析表明SYSV-O的P3蛋白在酵母体内与BD蛋白融合表达,并排除了对宿主细胞的毒害和自激活作用,可用于酵母双杂交文库的筛选。用Trizol提取洋葱总RNA,应用SMART技术合成第一链cDNA,然后用5′和3′PCR引物进行LD-PCR扩增双链cDNA,与pGADT7-Rec、pGBKT7-（SYSV-O） P3共转化酵母菌AH109,根据对3个报告基因ADE2、HIS3、MEL1的检测筛选了9个阳性候选克隆。抽提阳性候选克隆的质粒,PCR检测,结果9个阳性候选克隆的插入片段大小约为700bp左右。对9个阳性克隆的质粒进行测序,序列经Blast比对分析后发现9个候选克隆的核苷酸序列相同,为洋葱1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）大亚基3′端序列。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 胡葱黄条病毒的研究进展
• 1.1 SYSV 生物学特性
• 1.1.1 寄主范围及危害症状
• 1.1.2 株系的划分
• 1.1.3 传播方式
• 1.1.4 病毒粒子形态和细胞病理学特性
• 1.1.5 血清学
• 1.1.6 基因组特性
• 1.2 基因组结构与编码蛋白的功能
• 2 马铃薯 Y 科病毒基于基因组序列的分类标准
• 3 酵母双杂交技术
• 3.1 酵母双杂交系统的基本原理
• 3.2 酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用
• 3.2.1 筛选与病毒作用的寄主蛋白
• 3.2.2 确定已知蛋白之间的相互作用
• 3.2.3 在病毒介体传播的分子机制研究中的应用
• 3.3 酵母双杂交系统在植物病毒学中应用的展望
• 第二章 胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物基因组
• 1 试验材料
• 1.1 供试毒源
• 1.2 菌种、质粒和试剂
• 1.2.1 菌种与载体质粒
• 1.2.2 试剂
• 1.2.3 引物设计与合成
• 2 实验方法
• 2.1 病毒提纯
• 2.2 电子显微镜观察
• 2.2.1 浸出法
• 2.2.2 免疫电镜
• 2.2.3 常规超薄切片
• 2.3 RNA 提取
• 2.4 逆转录合成第一链cDNA
• 2.5 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.6 克隆
• 2.6.1 DNA 片段切胶纯化
• 2.6.2 T-A 连接
• 2.6.3 感受态细胞制备（CaCl2 法）
• 2.6.4 转化和筛选
• 2.6.5 质粒提取
• 2.6.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 序列测定和分析
• 2.8 基于生物信息学方法的SYSV-O P3 蛋白跨膜结构域预测
• 2.9 外源基因原核表达
• 2.9.1 SYSV-O-CP 诱导表达及SDS-PAGE 检测
• 2.9.2 抗血清制备
• 2.9.3 Western blot 检测抗血清
• 3 结果分析
• 3.1 电镜观察
• 3.2 RNA 提取及检测
• 3.3 SYSV-O 有关基因的RT-PCR 扩增
• 3.4 SYSV-O 各基因的T-A 克隆
• 3.5 SYSV-O cDNA 全序列
• 3.6 SYSV-O 基因组结构分析
• 3.6.1 SYSV-O 的基因组全序列结构特征
• 3.6.2 编码蛋白结构特征
• 3.6.3 序列分析
• 3.7 SYSV-O P3 蛋白的跨膜结构预测
• 3.7.1 利用Hydropathy plots 进行SYSV-O P3 疏水性图谱分析
• 3.7.2 用TMHMM2.0 预测跨膜结构域
• 3.8 SYSV-O CP 基因的原核表达
• 3.8.1 SYSV-O CP 基因的扩增及连接T 载体
• 3.8.2 CP 基因原核表达载体的构建
• 3.8.3 CP 基因原核表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3.8.4 Western blot 检测SYSV-O CP
• 3.8.5 SYSV、LYSV 和OYDV CP 的血清学关系
• 第三章 与胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物P3 蛋白互作的寄主蛋白筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 主要试剂及试剂盒
• 1.1.3 引物
• 2 实验方法
• 2.1 酵母菌株的活化
• 2.2 酵母表型鉴定
• 2.3 酵母双杂交载体pGBKT7-（SYSV-O） P3 的构建与表达
• 2.3.1 酵母双杂交载体pGBKT7-（SYSV-O） P3 的构建
• 2.3.2 酵母双杂交载体pGBKT7-（SYSV-O） P3 电击法转化酵母 AH109
• 2.3.3 DNA-BD/（SYSV-O） P3 融合蛋白自激活作用检测
• 2.3.4 DNA-BD/（SYSV-O） P3 融合蛋白对酵母菌AH109 的毒性检测
• 2.3.5 DNA-BD/（ SYSV-O） P3 融合蛋白的表达
• 2.4 洋葱总RNA 的提取与检测
• 2.4.1 Trizol 法提取总RNA
• 2.4.2 RNA 样品OD 值检测
• 2.4.3 RNA 电泳检测
• 2.4.4 第一链cDNA 合成
• 2.4.5 LD-PCR 合成和扩增ds cDNA
• 2.5 酵母感受态细胞制备（ LiAc 法）
• 2.6 洋葱ds cDNA 和Sma I 酶切后的pGADT7-Rec 共转化酵母菌株AH109
• 2.7 阳性克隆的初步鉴定
• 2.8 阳性克隆的进一步确证
• 2.8.1 阳性克隆质粒的自激活检测
• 2.8.2 回复杂交
• 2.8.3 阳性克隆质粒与空载体pGBKT7 共转化 AH109
• 2.8.4 阳性克隆质粒与pGBKT7-lam 共转化 AH109
• 2.9 阳性克隆测序
• 3 结果与分析
• 3.1 酵母菌株表型鉴定结果
• 3.2 pGBKT7-（SYSV-O） P3 载体的构建及其在酵母中的表达检测
• 3.2.1 目的基因的获得
• 3.2.2 重组质粒pGBKT7-（SYSV-O） P3 的鉴定
• 3.3 DNA-BD/（SYSV-O） P3 融合蛋白的自激活排除
• 3.4 DNA-BD/（SYSV-O） P3 融合蛋白对酵母菌 AH109 的毒性检测
• 3.5 酵母双杂交载体pGBKT7-（SYSV-O） P3 在酵母菌AH109 中的表达
• 3.6 洋葱总RNA 的质量评定
• 3.7 双链cDNA 的合成
• 3.8 洋葱cDNA 文库的筛选
• 3.8.1 阳性克隆的初步筛选
• 3.8.2 阳性克隆的进一步验证
• 3.9 测序结果与分析
• 3.10 讨论
• 第四章 结论及进一步的研究建议
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介