胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建及flp和dam基因的初步研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成了严重的经济损失,疫苗免疫接种是预防和控制该病的主要措施。目前,研究人员已经从APP中鉴定到了许多毒力因子,包括4种RTX外毒素、荚膜多糖（CP）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（Tbp）、粘附素、蛋白酶等。根据这些毒力因子的特点和功能,研究人员开发了许多候选疫苗,但用于临床的主要是灭活苗和亚单位疫苗,它们的免疫保护力均有限,特别是不能提供对不同血清型的免疫保护作用,因此,迫切需要开发新型高效疫苗来预防和控制该病的发生与流行。病原分子生物学与致病机理的研究是新型疫苗设计与开发的基础。本论文主要对APP的flp和dam基因的结构与功能进行了初步研究,并完成了APP信号标签突变（signature-tagged mutagenesis,STM）体库构建的部分内容,为APP新的毒力相关基因的发掘奠定了基础。1.胸膜肺炎放线杆菌flp基因缺失突变株的构建及生物学特性在细菌中广泛存在flp（fimbrial low-molecular-weight protein）操纵子,由13-15个基因组成,主要编码和形成一种类菌毛（Flp菌毛）的束状纤维蛋白,可能与细菌的黏附和定植有关。flp是该操纵子中的重要编码基因,编码Flp菌毛的主要结构蛋白。基因组分析表明,APP的flp操纵子编码2个拷贝的flp（flp-1和flp-2）并首尾相接。为了研究Flp蛋白的功能,本实验设计并构建了重组质粒pEMOC2-flpLR,通过同源重组和抗性—蔗糖双筛选技术获得了无抗性标记的APP血清1型flp-1/flp-2双基因缺失菌株。体内外试验发现,flp的缺失对APP体外生长未见明显影响,但flp基因缺失突变株丧失了形成特殊的束状纤维蛋白的能力,对小鼠的毒力显著降低。2.DNA甲基化对胸膜肺炎放线杆菌毒力的调控作用腺嘌呤甲基转移酶（Dam）引起的甲基化作用可以调节细菌大量的生理过程,包括染色体复制、错配修复、转座、转录等,其分子机制是DNA特定位点甲基化程度不同导致DNA结合蛋白亲和力发生改变。本实验克隆了APP的dam基因表达盒,并克隆到革兰氏阴性菌的广谱穿梭质粒pJN105中,构建了重组表达质粒pJN105-dam,在dam- E.coli中验证了其Dam活性;然后电转化到APP血清1型菌株中,得到了dam过表达菌株,体内外试验发现,dam过表达可以抑制APP在体外培养条件下的生长速度和对绵羊红细胞的溶血能力,同时可以降低对小鼠的毒力。3.STM突变体库的构建STM技术是一种高通量的利用负筛选的方法来寻找病原细菌毒力基因的技术。本实验通过对mating方法的摸索,确立了比较成熟的双亲本mating方法的条件,完成了48个STM转座子标签中的4个标签（Tag 1、Tag 2、Tag 15和Tag 16）的突变体库的构建,得到了212个突变体,发现了一株生物被膜形成突变体。目前,在其它同事的协作下完成了全部标签的突变体库的构建,为新的功能基因的发掘奠定了基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现及基本特征
• 1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学及其危害
• 1.2.1 猪传染性胸膜肺炎的流行病学
• 1.2.2 猪传染性胸膜肺炎的危害
• 1.3 胸膜肺炎放线杆菌的毒力相关因子
• 1.3.1 外毒素
• 1.3.2 荚膜
• 1.3.3 脂多糖
• 1.3.4 外膜蛋白
• 1.3.5 转铁结合蛋白
• 1.3.6 酶类
• 1.3.7 鞭毛和菌毛
• 1.4 胸膜肺炎放线杆菌突变株构建方法的研究进展
• 1.4.1 自然突变
• 1.4.2 化学诱变
• 1.4.3 分子生物学方法
• 1.5 基因的甲基化
• 1.5.1 DNA甲基化的主要形式
• 1.5.2 甲基化对基因表达的影响
• 1.5.3 甲基化调控基因表达的机制
• 第2章 胸膜肺炎放线杆菌flp基因缺失突变体构建及生物学特性研究
• 2.1 目的和意义
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 主要药品和试剂配制
• 2.2.3 主要培养基和抗生素
• 2.2.4 寡核甘酸引物
• 2.2.5 试验动物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细菌活化
• 2.3.2 细菌基因组DNA的提取
• 2.3.3 细菌RNA的提取
• 2.3.4 反转录PCR
• 2.3.5 PCR扩增
• 2.3.6 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 2.3.7 质粒DNA的连接
• 2.3.8 质粒的小量制备
• 2.3.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.10 连接产物及质粒的转化
• 2.3.11 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.12 胸膜肺炎电转感受态的制备及电转化
• 2.3.13 重组自杀性质粒pEMOC2-flpLR的构建
• 2.3.14 接合转移与胸膜肺炎放线杆菌flp基因缺失株的筛选
• 2.3.15 溶血性试验
• 2.3.16 生长特性试验
• 2.3.17 动物试验
• 2.3.18 透射电镜对细菌表型观察
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 重组质粒pEMOC2-flpLR的构建
• 2.4.2 重组质粒pEMOC2-flpLR导入APP及缺失菌株筛选
• 2.4.3 突变株的鉴定以及缺失对操纵子的影响
• 2.4.4 突变株的溶血性试验
• 2.4.5 突变株生长特性试验
• 2.4.6 动物试验
• 2.4.7 电镜观察结果
• 2.5 讨论
• 2.5.1 重组质粒构建方法的选择
• 2.5.2 缺失突变株形态毒力的变化
• 2.6 结论
• 第3章 胸膜肺炎放线杆菌dam基因过表达菌株的研究
• 3.1 目的及意义
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 寡核甘酸引物
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 培养基和抗生素
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 基因的克隆
• 3.3.2 重组质粒pJN105-dam的构建
• 3.3.3 重组质粒pJN105-dam中dam基因活性鉴定
• 3.3.4 胸膜肺炎放线杆菌的电转化
• 3.3.5 过表达菌株的溶血性试验
• 3.3.6 生长特性试验
• 2.3.7 半数致死量试验
• 3.3.8 荧光定量对过表达菌株的毒素表达检测
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 pJN105-dam穿梭质粒的构建
• 3.4.2 重组质粒中dam基因表达活性的检测
• 3.4.3 过表达菌株溶血性试验
• 3.4.4 过表达菌株的生长特定试验
• 3.4.5 过表达菌株的毒力试验（LD50）
• 3.4.6 荧光定量检测毒素基因表达
• 3.5 讨论
• 3.5.1 质粒pJN105在胸膜肺炎放线杆菌中的稳定性
• 3.5.2 细菌生长特性的减慢的影响
• 3.6 结论
• 第4章 膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建
• 4.1 目的及意义
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 培养基、抗生素及其他试剂的配制
• 4.2.3 寡聚核苷酸引物
• 4.3 方法
• 4.3.1 Mating法筛选突变体
• 4.3.2 突变体的鉴定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 突变体的筛选鉴定
• 4.4.2 部分突变体库的建立
• 4.5 讨论
• 4.5.1 Mating法确定
• 4.5.2 关于筛选过程中抗生素浓度的确定
• 4.6 结论
• 小结
• 参考文献
• 致谢