论文摘要
牙周疾病治疗的理想效果不仅在于终止病变本身，更在于促进牙周组织的再生，从而达到牙周组织结构与功能的完全恢复。骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是一种具有高度骨诱导活性的细胞因子家族，在众多的亚型中，骨形成蛋白-2（BMP-2）是BMPs家族中诱骨活性最强的一种，也是能单独诱导成骨的因子，其在牙周组织再生和修复中具有重要的作用。但仅靠外源性植入，BMPs在骨损伤部位存在的时间及浓度是有限的，往往不能满足某些骨损伤修复的需要，尚不能达到牙周组织完全再生的目的。基因治疗技术引入牙周病治疗的研究领域，为这一目标的实现带来了新的希望。以往的病毒和非病毒两大类转基因载体各有其优缺点，无毒副作用又具有靶向性的基因载体已成为基因治疗研究特别是体内研究中的一个新的目标。近年来，国内外学者的研究显示，通过超声介导微泡破裂法，能促进目的基因安全而有效的定向转移，增加外源性基因转化率和表达水平，该方法有可能成为基因治疗研究中新的突破点。本文中拟通过PCR、T／A克隆等DNA重组技术，构建含增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）的重组人骨形成蛋白-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）基因真核表达质粒；通过体外实验，探讨超声介导微泡破裂法对目的基因转染靶细胞的影响，为评价超声微泡法在动物体内的基因转染和在牙周骨组织再生中应用的可行性提供理论依据。实验一含增强型绿色荧光蛋白的重组人骨形成蛋白-2基因真核表达载体的构建方法：1．PCR扩增rhBMP-2基因，并在两端添加合适的酶切位点。2．利用定向克隆技术将rhBMP-2基因和EGFP基因分别插入到载体pIRES的上下游多克隆位点中，两者通过IRES连接以防止两者融合表达。3．重组的pIRES-rhBMP2-EGFP在大肠杆菌DH5α（escherichia coli DH5α，E．coli DH5α）内扩增后，通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建成功。结果：通过对重组质粒pIRES-rhBMP2-EGFP进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析，证明真核表达重组质粒pIRES-rhBMP2-EGFP构建成功，开放阅读框架正确。结论：利用PCR、T／A克隆等分子生物学技术可成功地将编码rhBMP-2的DNA片段和EGFP片段克隆到载体pIRES中，构建出重组子pIRES-rhBMP2-EGFP。实验二超声介导微泡破裂法促进外源性基因在小鼠NIH3T3成纤维细胞中的表达方法：1．细胞培养：复苏NIH3T3细胞并传代3到4次，待细胞生长状态良好后接种至六孔培养板。2．质粒DNA的转染：六孔板中细胞随机分为两组，分别采用质粒DNA+脂质体法（D+LF组）和质粒DNA+超声+微泡法（D+U+M组）转染目的基因。3．检测项目与观察指标：转染24～48h后对各组细胞分别进行荧光显微镜下计数以计算转染效率，并进行酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）以测定转染后hBMP-2蛋白浓度。4．使用SPSS11.5软件包分析实验结果：采用t检验对两组转染效率进行分析，采用曲线拟合和t检验对ELISA结果进行分析，P＜0.05表示有统计学意义。结果：脂质体组的转染效率为7.30±1.58％，超声介导微泡破裂组为11.77±3.16％（P＜0.05）；脂质体组的转染后hBMP-2蛋白浓度为1164.35±724.67pg／ml，超声介导微泡破裂组为2932.70±656.27pg／ml（P＜0.05）。结论：超声介导微泡破裂法可以明显提高外源性基因rhBMP-2在体外NIH3T3细胞中的转染效率和蛋白浓度，可以为牙周再生基因治疗提供一种新型基因转移系统。
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