论文摘要
磷酸二酯酶（PDEs）是一个超级酶家族,在细胞外核苷酸代谢和调节以核苷酸为基础的细胞内信号等功能中有多重作用。PDEs影响多个途径的生理学过程,包括早期炎症介质的生成及发展,离子通道,肌肉收缩,脂肪生成,肝糖生成和糖质分解等。PDEs广泛存在于蛇毒中,一般都是大分子量（>90kDa）,单个多肽链的蛋白。PDEs有广泛的底物特异性,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）,烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸（NGD）,ATP, ADP等生物体内重要的核苷酸,都能被它水解。虽然有些PDEs已经从蛇毒中被分离出来,但是它们的氨基酸或者全长cDNA序列到现在都没有可参考的信息。到目前为止,竹叶青蛇毒中还没有分离纯化出PDE,鉴于PDEs多重的生理学功能,因此我们希望能从竹叶青蛇毒中分离出一种新型的PDE。本文主要讲述了竹叶青蛇毒中PDE的分离纯化,结构和酶活性。全文分为四章。第一章:概述了PDEs的研究进展,以及常用的研究蛋白质的实验手段。通过这一章可以对PDEs的生物学功能,分类,组织分布及晶体结构有全面的了解。文中同时也介绍了蛇毒中的PDEs的结构和酶活性。其次对研究蛋白质的几种常用手段做了总结,包括紫外光谱、荧光光谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质测序。第二章:文中首次介绍了通过离子交换色谱和凝胶过滤色谱从竹叶青蛇毒中提纯出磷酸二酯酶（TS-PDE）的方法。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了TS-PDE的分子量为100KD,并且是由二硫键连接的二聚体组成。通过毛细管等电聚焦电泳,我们测定出TS-PDE的等电点为5.1。另外,上述的两种检测方法也说明了TS-PDE是一种单一的蛋白质。我们通过Edman降解法对蛋白质N端序列进行了分析,TS-PDE的四个N端序列分别为:缬氨酸/丝氨酸,谷氨酰胺/亮氨酸,丙氨酸/酪氨酸,天冬氨酸/亮氨酸。由于两条链的N端氨基酸序列不同,因此TS-PDE是由二硫键连接的异型二聚体,与其它已知PDEs结构有所不同。另外,我们也测定了TS-PDE的糖含量。第三章:在本章中,我们主要研究了TS-PDE的酶活性及其对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用。实验中主要利用HPLC的方法,以NAD,NGD,ATP,ADP为底物,详细的阐述了TS-PDE的酶活性并测定了各个底物的酶动力学参数。PDEs有广泛的底物特异性,NAD,NGD, ATP,ADP均可被TS-PDE催化水解。在蛇毒中分离纯化PDE的过程中,经常出现的问题是纯化的PDE中含有5’-核苷酸酶和碱性磷酸酶的杂质。为了验证TS-PDE的纯度,我们分别以AMP和对-苯硝基磷酸盐为底物进行测定,结果在实验过程中均未发现有5’-核苷酸酶和碱性磷酸酶活性,这进一步证明了竹叶青蛇毒中纯化分离的TS-PDE是一种单一的酶。TS-PDE是从DNA的3’端开始逐一水解磷酸二酯键,释放5’-磷酸单核苷酸的,所以它可作为一种工具应用于寡聚和多聚核苷酸氨基酸序列的测定。我们同时测定了TS-PDE对ADP诱导的血小板聚集的影响,实验证明TS-PDE能够明显的抑制ADP诱导的血小板聚集,因此,它可能成为一种潜在的抗血栓药物。第四章:本章主要研究了金属离子和链间二硫键对TS-PDE酶活性和结构的影响。我们利用离子体发射光谱仪和质谱仪,测定TS-PDE结构中有Cu2+和Zn2+的存在。据我们所知,TS-PDE是唯一一个含有Cu2+的磷酸二酯酶。金属螯合物EDTA基本上能够完全抑制TS-PDE的酶活性,说明金属离子的存在对TS-PDE的酶活性是必需的。在去金属离子的TS-PDE（apo-TS-PDE）中加入Cu2+和Zn2+,对酶活性都有一定的恢复作用,说明TS-PDE的活性依赖于Cu2+和Zn2+。TS-PDE结构中含有7个二硫键,小分子还原剂（DTT、GSH、TCEP和Vc）基本能够完全抑制TS-PDE的酶活性。DTT、GSH和TCEP对TS-PDE结构中的二硫键的还原与酶活性的被抑制是同时发生的,说明TS-PDE的活性依赖于二硫键的存在。Vc使TS-PDE结构的二价金属离子还原到一价,这可能是TS-PDE酶失活的原因,这也进一步说明了TS-PDE的活性依赖于金属离子。