胸腺素α1（Tα1）的生物合成研究

论文摘要

胸腺素α1（Tα1）具有重要的免疫调节活性,在感染性疾病和癌症治疗方面具有潜力。此外,Tα1还具有佐剂作用,提高流感疫苗和乙肝疫苗的免疫效果。SciClone公司上市的Zadaxin（化学合成的Tα1）已在临床上用于乙肝、丙肝和肿瘤等疾病的治疗。化学合成的Tα1成本高,价格昂贵,本研究拟建立一种生物合成Tα1的方法以降低生产成本。Tα1是一个由28个氨基酸残基组成的多肽,其N-末端具有乙酰化修饰。其一级结构为:Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKE KKEVVEEAEN。应用基因工程技术制备Tα1目前还存在两大困难,一是N-末端乙酰化修饰;二是小分子多肽的表达。蛋白质的N-末端乙酰化修饰是在N-末端乙酰转移酶（N-terminal acetyltransferase,NAT）的催化下,将乙酰辅酶A（AcCoA）的乙酰基（Acetyl,CH3CO-,分子量43.018Da）转移到蛋白质的N-末端氨基酸残基的氨基上。一个蛋白质能否被N-末端乙酰化修饰至少取决于两个因素,一是蛋白质的氨基酸序列,二是有无相应的NAT存在。为了解决Tα1的乙酰化修饰问题,我们首先将Tα1与大肠杆菌内源性乙酰化蛋白（L12、S5和S18）融合进行表达,分别称为A2融合蛋白（Tα1-Cys-L12）、A5融合蛋白（Tα1-Cys-S5）和A8融合蛋白（Tα1-Cys-S18）。Tα1位于融合蛋白的N端,其后有一个Cys残基。融合蛋白只含有一个Cys残基,可以利用CDAP进行特异性切割,获得完整的Tα1。这三个融合蛋白基因克隆到载体pET22b上获得表达质粒pET-A2,pET-A5和pET-A8。在融合蛋白的C端增加了6个His残基,便于纯化。在表达纯化后,利用Q-TOF MS进行融合蛋白分子量分析,发现A2融合蛋白和A8融合蛋白均有部分存在乙酰化修饰。A5融合蛋白因难以纯化未进行分析。对A2融合蛋白进行胰蛋白酶消化,获得乙酰化的N端1-14肽段,对该肽段进行MS-MS测序,确证了乙酰化修饰发生在N端的第一个残基Ser上。从而证明Tα1融合蛋白可以在大肠杆菌内获得N-末端乙酰化修饰。在大肠杆菌内直接表达Tα1融合蛋白,只有部分融合蛋白获得了乙酰化修饰,还有一部分以非乙酰化修饰形式存在。如果要利用基因工程技术表达Tα1,使Tα1获得充分的N-末端乙酰化修饰是必要的。那么如何做到这一点呢?我们知道N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶催化的修饰过程。如果能找到修饰Tα1的相关NAT,提高该NAT的表达水平就有可能使表达Tα1融合蛋白完全乙酰化。根据这样的思路,采用Red重组技术敲除大肠杆菌内已知的NAT基因和推测的NAT基因,然后研究Tα1融合蛋白在各NAT基因敲除菌内表达后的修饰情况,寻找相关的NAT。我们成功地敲除了rimI、rimJ、rimL和yjaB四个基因。未能敲除yhhY、yjgM和yjhQ。为了方便以后利用天冬内酰胺酶或羟胺进行切割获得Tα1,构建了A22融合蛋白（Tα1-Gly-L12）,这样融合蛋白中就有Asn-Gly肽键。同样也在融合蛋白的C端增加了6个His残基,便于纯化。发现在rimJ敲除菌内表达时,A22融合蛋白不存在乙酰化修饰形式。而在出发菌和其他三个基因敲除菌内,A22融合蛋白都有乙酰化形式存在。这说明rimJ基因与Tα1融合蛋白的乙酰化修饰密切相关。为了进一步确证这一关系,我们进行了基因补救试验。将rimJ基因克隆到与pET22b相容的载体pACYCDeut-1中得到表达质粒pACYC-rimJ。将pET-A22与pACYC-rimJ共转化到rimJ敲除菌株内进行共表达,发现A22融合蛋白全部以乙酰化形式存在。这进一步说明,Tα1融合蛋白的乙酰化修饰是与rimJ基因直接相关的。又进一步,我们表达纯化了RimJ,以在rimJ敲除菌株内表达获得的非乙酰化的A22融合蛋白为酶底物,进行了体外乙酰化修饰研究。发现在AcCoA存在下,RimJ可以体外乙酰化修饰A22融合蛋白。同时没有AcCoA存在或RimJ存在时,A22融合蛋白不能发生乙酰化修饰。这说明,由AcCoA提供乙酰基团,RimJ具有催化Tα1融合蛋白进行乙酰化修饰的活性,不需要其他辅助亚基。这一点与真核来源的乙酰转移酶性质不同。真核NATs都是由两个以上不同亚基组成的。上述研究结果表明,Tα1融合蛋白在大肠杆菌中表达时可以获得N-末端乙酰化修饰,该修饰过程由大肠杆菌中修饰核糖体亚基蛋白S5的N-末端乙酰转移酶RimJ催化。而且与RimJ共表达,Tα1融合蛋白可以获得完全乙酰化修饰。Tα1难以直接进行胞内表达。采用融合表达需要对融合蛋白进行切割才能获得Tα1。根据Tα1结构特征,可以采用三种方法进行切割获得完整的Tα1。一是CDAP诱导的X-Cys肽键特异性切割方法;二是利用天冬内酰胺酶特异性切割Asn-Gly肽键的方法;三是Intein介导的N端切割方法。本文尝试了利用Intein介导切割获得Tα1的方法。本文选择了三种不同来源的Intein,分别是SplDnaX Intein（136个氨基酸残基,来源于Spirulina platensis）、PhoPol II Intein（166个氨基酸残基,来源于Pyrococcus horikoshii）和MxeGyrA Intein（198个氨基酸残基,来源于Mycobacterium xenopi）,构建了Tα1与Intein的融合蛋白的表达载体pET-AS、pET-AP和pET-AM。三种融合蛋白AS、AP和AM的C端都带有（His）6标签。将重组菌BL21（DE3）/pET-AS/pACYC-rimJ、BL21（DE3）/pET-AP/pACYC-rimJ和BL21（DE3）/pET-AM/pACYC-rimJ接入含有氨苄、氯霉双抗的FML液体培养基中,37℃、200rpm振荡培养约12h。离心收集菌体,破菌,三种融合蛋白都位于上清中。通过镍亲和层析柱纯化获得AS、AP和AM等融合蛋白。首先进行温度诱导水解切割研究。发现AS和AP两种融合蛋白可以在37℃以上时发生水解切割,尤其是55℃时孵育12h切割百分率达到50%以上。AM融合蛋白则不能发生水解切割,其在高温下易变性。但是AM融合蛋白很容易在巯基试剂诱导下发生硫解切割,尤其在低温切割百分率明显高于AS和AP两种融合蛋白。由于SplDnaX Intein的分子量较小,Tα1在其中所占的百分比最高,因而较容易获得高产量。因此,我们研究了利用DTT和β-ME诱导切割AS融合蛋白制备Tα1。在100 mmol/L DTT存在下,42℃孵育24 h,有90%左右的融合蛋白发生切割。每升培养液中的融合蛋白纯化后经DTT诱导切割可以获得56 mg纯度为73%的Tα1。应用串联质谱测定了Tα1全序列,表明其N-末端具有乙酰化修饰。因此,该方法具有实际应用潜力,值得进一步深入研究。综上所述,本文研究结果显示:1)Tα1融合蛋白（Tα1位于N端）在大肠杆菌中表达时有部分融合蛋白的N末端被乙酰化修饰,而且这种修饰与大肠杆菌内源性N-末端乙酰转移酶RimJ有关。2)与RimJ基因共表达,Tα1可以完全被乙酰化修饰。3)应用Intein介导的N端切割技术制备具有N-末端乙酰化修饰的Tα1具有发展潜力。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 胸腺素α1（Tα1）
• 1.1.1 胸腺素的发现
• 1.1.2 Tα1 的生物学功能
• 1.1.3 Tα1 的临床应用
• 1.1.4 Tα1 的制备
• 1.2 蛋白质/多肽的N-末端乙酰化修饰
• 1.2.1 N-末端乙酰化修饰的意义
• 1.2.2 蛋白质N-末端乙酰化修饰的结构需求
• 1.2.3 N-末端乙酰化转移酶
• 1.2.4 大肠杆菌细胞内蛋白质的N-末端乙酰化修饰
• 1.3 基因工程方法制备低分子量多肽
• 1.3.1 融合蛋白的化学切割
• 1.3.2 特异性蛋白酶切割
• 1.3.3 Intein介导的切割
• 1.3.4 分泌表达
• 1.4 质谱分析技术及其在蛋白质研究中的应用
• 1.4.1 MALDI-TOF-MS
• 1.4.2 ESI-MS和ESI-MS/MS
• 1.4.3 质谱分析样品的制备
• 1.4.4 质谱分析在蛋白质结构研究中的应用
• 1.5 本课题的研究思路
• 1.5.1 如何在大肠杆菌内实现Tα1 的乙酰化修饰
• 1.5.2 如何切割融合蛋白获得N-末端乙酰化的Tα1
• 第二章 胸腺素α1（Tα1）的融合表达研究
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 Tα1 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.3.2 在大肠杆菌中表达的Tα1 融合蛋白存在N-末端乙酰化修饰
• 2.4 讨论
• 2.4.1 Tα1 表达载体的构建
• 2.4.2 融合蛋白的表达及纯化
• 2.4.3 质谱分析样品的制备
• 2.4.4 利用质谱分析技术确定乙酰化修饰位点
• 2.4.5 异源蛋白在大肠杆菌表达的乙酰化修饰
• 第三章 修饰Tα1 的N-末端乙酰转移酶的筛选与确证
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 Tα1-Gly-L12 融合蛋白（A22）在rimJ敲除菌内表达时不存在乙酰化修饰
• 3.3.2 A22 融合蛋白与RimJ在敲除菌内共表达可获得充分乙酰化修饰
• 3.3.3 RimJ可体外乙酰化修饰A22 融合蛋白
• 3.4 讨论
• 3.4.1 影响Red同源重组效率的因素
• 3.4.2 决定Tα1 乙酰化修饰的NAT
• 第四章 利用Intein介导的切割技术制备Tα1
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 AS、AP和AM等融合蛋白的表达
• 4.3.2 温度对AS、AP和AM等融合蛋白切割的影响
• 4.3.3 DTT诱导AS、AP和AM等融合蛋白的切割
• 4.3.4 融合蛋白AS硫解切割产物的纯化和质谱分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 Intein对切割效率的影响
• 4.4.2 切割过程中Tα1 的C末端Asn残基脱水机理分析
• 4.4.3 未来发展
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录2-1 Tβ4 与L12 融合蛋白的序列及其在大肠杆菌中表达产物的Q-TOF MS分析
• 附录3-1 大肠杆菌基因组上已知和推测具有N-末端乙酰转移酶活性的相关基因及其上下游DNA序列
• 附录3-2 在不同菌株中表达的重组融合蛋白A22 的Q-TOF MS分析
• 附录3-3 Rim J催化非乙酰化A22 融合蛋白的体外修饰实验，利用Q-TOF MS测定A22 融合蛋白的分子量
• 附录4-1 图4-10 中峰1 和峰2 串联质谱测序图
• 蛋白质剪接研究进展
• 个人简历
• 致谢