鸡胚胎死亡相关基因的研究及胚盘性别鉴定技术的建立

论文摘要

为了研究整个孵化期的鸡胚胎死亡规律、雌性和雄性胚胎死亡规律,以及胚胎发育相关基因的变异对胚胎死亡和种蛋品质的影响,本试验以温氏集团培育的星星黄鸡,矮脚黄鸡和竹丝鸡三个品种的种蛋和胚胎为研究对象,对与人和小鼠胚胎发育相关的Fas,Wnt-1诱导的分泌蛋白（Wnt-1-induced secreted protein,WISP-1）和N-myc（和STAT）相互作用子（N-myc（and STAT）interactor,Nmi）,维甲酸X受体α亚型（retinoic acid X receptorα,RXRα）,胰岛素样生长因子2受体（Insulin-like growthfactor typeⅡreceptor,IGF2R）等五个基因进行了SNP位点的筛选和多态性检测;探讨了基因SNP多态性及其与胚胎死亡、种蛋品质的相关性;同时建立了用于少量细胞（胚盘）性别鉴定的分子生物学方法,并探讨早期胚胎死亡性别及胚盘的性别。主要研究结果如下:1、利用双重PCR技术,建立了用于少数细胞鉴定性别的分子生物学方法,可用于鉴定新鲜种蛋的胚盘和孵化早期胚胎的性别。并申请和获得了专利,专利号为200710052846.X。2、对110枚新鲜种蛋进行了胚盘性别鉴定,初步结果表明雌性胚胎多于雄性胚胎。3、在整个孵化期的鸡胚胎死亡出现两个死亡高峰期,在第一个死亡高峰期,有雌性死亡胚胎数比雄性胚胎死亡数多的趋势。4、在5个基因中,共检测了15个SNP,选择其中7个导致氨基酸改变的SNP,对星星黄鸡200个胚胎、矮脚黄鸡269个胚胎和竹丝鸡235个胚胎进行了SNP多态性及其与胚胎死亡和种蛋品质相关性进行了分析。5、在Fas基因检测出了3个SNP位点,测定了其中导致氨基酸改变的两个SNP位点。鸡Fas基因第3外显子XbaⅠ-RFLP不同基因型的胚胎相对死亡率在不同品种中不同,存在显著的品种差异。基因多态对星星黄鸡,矮脚黄鸡和竹丝鸡的胚胎相对死亡率都有显著的影响（P＜0.05）。鸡Fas基因第2外显子XbaⅠ-RFLP基因多态对矮脚黄鸡的胚胎相对死亡率没有显著的影响（P＞0.05）。6、在WISP-1基因中检测出了5个SNP位点,测定了第5外显子上的1个导致氨基酸改变的SNP位点。鸡WISP-1基因第5外显子HaeⅢ-RFLP基因多态对矮脚黄鸡和竹丝鸡的胚胎相对死亡率有接近显著的影响（P=0.058和P=0.081）。不同基因型的胚胎相对死亡率在不同品种中不同,存在着品种差异;而在新兴黄鸡中三种基因型的相对死亡率极其相近,没有差异（P＞0.05）。7、在Nmi基因中检测出了5个SNP位点,测定了第2外显子和第5外显子上的2个导致氨基酸改变的SNP位点。鸡Nmi基因第2外显子HindⅢ-RFLP基因多态对矮脚黄鸡的胚胎相对死亡率没有显著的影响（P＞0.05）。鸡Nmi基因第5外显子HinfⅠ-RFLP基因多态对矮脚黄鸡的胚胎相对死亡率有显著的影响（P＜0.05）,但是在竹丝鸡中却差异不显著。8、RXRα基因的第2外显子HhaⅠ-RFLP SNP多态对对星星黄鸡胚胎成活有显著影响,对矮脚黄鸡胚胎成活没有显著的影响。9、IGF2R基因的第34外显子BlwnⅠ-RFLP基因SNP多态对星星黄鸡中检测到的对胚胎成活有显著影响,对竹丝鸡胚胎成活不存在显著的影响。10、单倍型分析显示,在Fas上的两个检验的SNP位点的连锁程度比较高（D′=0.9146,r2=0.3194）,而在Nmi上的两个检验的SNP位点的连锁程度比较低（D′=0.3303,r2=0.063）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 影响孵化率的因素
• 1.3 家禽性别鉴定和控制研究状况
• 1.3.1 形态学方法
• 1.3.2 分子生物学方法
• 1.4 胚胎发育相关基因的研究状况
• 1.4.1 Fas基因研究进展
• 1.4.2 Wnt-1诱导的分泌蛋白（WISP-1）基因研究进展
• 1.4.3 N-myc（和STAT）相互作用子（Nmi）基因研究进展
• 1.4.4 维甲酸受体（RXRα）基因研究进展
• 1.4.5 胰岛素样生长因子Ⅱ受体（IGF2R）基因研究进展
• 1.5 遗传标记与基因突变检测方法
• 1.5.1 遗传标记
• 1.5.2 基因突变的检测
• 2 研究的目的和意义
• 3 材料和方法
• 3.1 试验材料和仪器设备
• 3.1.1 种鸡和种蛋
• 3.1.2 DNA样品
• 3.1.3 主要试剂及配制
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 主要分子生物学分析软件和数据统计分析软件
• 3.2 主要研究方法
• 3.2.1 孵化试验及试验样本的采集
• 3.2.2 胚盘和胚胎组织DNA的提取及其性别鉴定
• 3.2.3 基因组DNA质量和浓度的检测
• 3.2.4 PCR反应程序、产物检测
• 3.2.5 PCR产物的回收测序
• 3.2.6 PCR产物的酶切分型
• 3.2.7 酶切产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 3.3 五个候选基因SNP寻找及SNP检测
• 3.3.1 鸡FAS基因SNP位点寻找及其SNP位点的检测
• 3.3.2 鸡WISP-1基因SNP位点寻找及其SNP位点的检测
• 3.3.3 鸡Nmi基因SNP位点寻找及其SNP位点的检测
• 3.3.4 鸡RXRα基因SNP位点寻找及其SNP位点的检测
• 3.3.5 鸡IGF2R基因SNP位点寻找及其SNP位点的检测
• 4 结果与分析
• 4.1 整个孵化期鸡胚胎、雄性胚胎和雌性胚胎死亡规律
• 4.1.1 矮脚黄鸡孵化期不同性别胚胎死亡分布规律
• 4.1.2 竹丝鸡孵化期不同性别胚胎死亡分布规律
• 4.2 孵化过程中种蛋失重规律分析
• 4.3 新鲜种蛋胚盘性别鉴定方法优化及其性别比例分析
• 4.3.1 巢式PCR性别鉴定技术的建立
• 4.3.2 胚盘性别鉴定及其性比分析
• 4.4 鸡Fas基因变异及其对胚胎成活、蛋品质的的遗传效应分析
• 4.4.1 鸡Fas基因SNP的检测方法
• 4.4.2 鸡Fas基因SNP位点的多态性检测
• 4.4.3 鸡Fas基因变异对胚胎成活产生的遗传效应分析
• 4.4.4 鸡FAS不同基因型与种蛋品质的关联分析
• 4.5 鸡WISP-1基因变异及其对胚胎成活、蛋品质的的遗传效应分析
• 4.5.1 鸡WISP-1基因SNP的检测方法
• 4.5.2 鸡WISP-1基因SNP位点的多态性检测
• 4.5.3 鸡WISP-1基因变异对胚胎成活产生的遗传效应分析
• 4.5.4 鸡WISP-1基因不同基因型与种蛋品质的关联分析
• 4.6 鸡Nmi基因变异及其对胚胎成活、蛋品质的的遗传效应分析
• 4.6.1 鸡Nmi基因SNP的检测
• 4.6.2 鸡Nmi基因SNP位点的多态性检测
• 4.6.3 鸡Nmi基因变异对胚胎成活产生的遗传效应分析
• 4.6.4 鸡Nmi基因不同基因型与种蛋品质的关联分析
• 4.7 鸡RXRα基因变异及其对胚胎成活、蛋品质的遗传效应分析
• 4.7.1 鸡RXRα基因SNP的检测
• 4.7.2 鸡RXRα基因变异对胚胎成活产生的遗传效应分析
• 4.7.3 鸡RXRα不同基因型与种蛋品质的关联分析
• 4.8 鸡IGF2R基因变异及其对胚胎成活、蛋品质的的遗传效应分析
• 4.8.1 鸡IGF2R基因SNP的检测
• 4.8.2 鸡IGF2R基因变异对胚胎成活产生的遗传效应分析
• 4.8.3 鸡IGF2R不同基因型与种蛋品质的关联分析
• 4.9 鸡的部分SNP位点的连锁不平衡及其单倍型分析
• 4.9.1 鸡Fas基因两个位点之间的连锁不平衡及其单倍型分析
• 4.9.2 鸡Nmi基因两个位点之间的连锁不平衡及其单倍型分析
• 5 讨论
• 5.1 关于种蛋孵化过程中胚胎死亡规律、雄性雌性死亡规律的研究
• 5.2 关于候选基因法及候选基因的选择
• 5.3 关于基因的多态性检测与性状的关联分析
• 5.4 关于多态性数据分析的讨论
• 6 小结
• 6.1 本研究的主要结论
• 6.2 本研究的创新点
• 6.3 本研究的不足与进一步研究的内容
• 参考文献
• 附录
• 致谢