漆酶基因转化羊草的研究

论文摘要

羊草（Leymus chinensis）是分布于我国北方天然草地面积较广、营养价值较高的禾本科牧草,近年来,羊草草原缺乏科学管理,以及过度放牧等不利影响,加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁,羊草资源日趋退化;其次,由于羊草中过高的木质素含量,不利于它在动物体内的消化分解,因此为了使畜牧业更为健康的发展,需要选育木质素含量较低的新品种,漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质,属于铜蓝氧化酶,存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中,发生反应后唯一的产物就是水,它本质上是一种环保型酵素,我们可以用漆酶基因转化羊草,以Bar基因作为筛选标记,以期获得低木质素含量的转基因羊草,最终提高羊草中营养成分在动物体内的利用率,本课题主要取得了以下成果:1、通过对羊草种子愈伤的诱导和再生条件的改进,初步建立了羊草再生体系,重新优化了羊草遗传转化受体系统。（1）提高了羊草愈伤组织诱导率为了提高成熟胚的胚性愈伤组织的诱导率,设计了不同的培养基及不同的激素浓度。羊草愈伤组织诱导采用MS培养基,当培养基中激素2,4-D的浓度达到2.0mg/L时即可达到较好的诱导效果,诱导率为20%,当浓度为2.0 mg/L时诱导率达到了30%,羊草愈伤组织诱导的最佳2,4-D浓度为2.0mg/L.（2）羊草愈伤组织的继代培养条件的优化羊草愈伤组织继代培养的最佳2,4-D浓度为1.5-2.0mg/L.N6和MS培养基是较适宜的羊草愈伤组织继代培养基,通过这两种培养基交替培养可以改善愈伤的状态。在继代培养中蔗糖较适宜的浓度为30-40g/l。培养基中脯氨酸浓度为2500mg/L,是羊草愈伤组织的生长以及胚性状态保持较适宜的浓度。（3）羊草愈伤组织的分化及再生条件的优化培养基中加入1mg/L 6-BA为羊草愈伤组织分化最佳条件,分化率达到了25%。生根培养基中加入NAA的最适宜浓度为2.0mg/L。如果在愈伤组织分化前进行预分化10-30天,可以明显提供分化出苗率。2、羊草愈伤组织耐除草剂敏感性测定综合增重指数和愈伤组织生长状态两种因素考虑,羊草愈伤组织在高Basta浓度条件下,可以筛选出耐除草剂突变体植株。从0mg/L开始筛选,通过逐步提高Basta浓度的方法,最终获得了筛选浓度为20mg/L耐除草剂植株的愈伤组织,并成功分化出6株幼苗。经形态学观察发现其叶色浅绿,株型低矮,与一般分化植株明显不同。3、羊草基因枪转化系统的优化不同的轰击距离（6cm、9cm、12cm）转化效率不同。随着轰击距离的加大,转化效率逐渐降低,当距离为6cm时,枪击后细胞受损严重,褐化较多,因此9 cm轰击距离较为适宜。DNA用量为每枪6ul（含300ug金粉和1.2ug DNA）,1100psi×9cm的压力×靶距组合,转化效果最好。4、Gus基因在羊草愈伤组织的瞬时表达通过农杆菌介导法侵染羊草愈伤组织,得到gus阳性结果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 羊草育种研究进展
• 1.1 羊草植物学特性
• 1.2 羊草解剖学特性
• 1.3 物候特征
• 1.4 羊草营养成分的比较研究
• 1.5 羊草的遗传学研究
• 1.6 羊草资源及利用
• 1.7 羊草育种现状
• 2 生物技术在羊草育种中的应用
• 2.1 细胞工程
• 2.2 分子标记技术
• 2.3 羊草和其他禾本科牧草生物技术研究进展
• 2.4 培育转基因羊草新品种的方法
• 3 遗传转化方法的研究进展
• 3.1 农杆菌介导法
• 3.2 花粉管通道转化技术
• 3.3 转基因作物的安全性问题
• 4 关于Bar和Laccase基因
• 5 本项研究的目的和意义
• 第二部分 羊草离体培养和诱导植株再生的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 种子萌发
• 2.2 愈伤组织诱导的研究
• 2.3 愈伤组织继代的研究
• 2.4 羊草愈伤分化的研究
• 2.5 愈伤分化生根培养
• 2.6 移栽
• 3 讨论
• 第三部分 羊草愈伤组织抗除草剂的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 羊草愈伤组织抗除草剂测定
• 2 结果与分析
• 2.1 羊草愈伤组织对Basta耐受能力
• 2.2 羊草愈伤组织生长量与培养基PH值的关系
• 2.3 体细胞突变筛选抗除草剂变
• 3 讨论
• 第四部分 羊草基因转化的研究
• 1 基因枪转化羊草的研究
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果与分析
• 1.4 讨论
• 2 农杆菌介导法转化羊草愈伤组织的研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 展望
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 图版说明
• 致谢
• 作者简介