大鼠外周血中性粒细胞在较长细菌刺激时期内的生物学反应特性及其意义

论文摘要

中性粒细胞是一类重要的吞噬细胞，是机体非特异性免疫系统抗御病原微生物感染的重要屏障。目前普遍认为中性粒细胞的抑菌杀菌机制是通过吞噬、灭活、消化等细胞内机制实现的。其细胞内抑菌杀菌作用与呼吸爆发时NADPH氧化酶介导产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及颗粒泡内蛋白水解酶直接相关，此过程在30分钟左右基本完成。这种抑菌杀菌机制的建立主要基于利用纯化的中性粒细胞进行的大量体外实验研究结果。这些研究主要观察从中性粒细胞与调理素结合的细菌或产物混合至呼吸爆发完成很短时间内相应实验指标的变化，缺乏有关反应时间长于30分钟的实验资料的报道。本文研究了较长细菌刺激时期内（约300分钟）大鼠外周血中性粒细胞的生物学反应特性及其意义。主要采用细胞耗氧、化学发光等检测方法研究系统氧耗变化，活性氧物质生成反应，用细菌培养方法研究中性粒细胞抑菌杀菌机制，采用细胞培养、染色、光学显微镜形态学方法研究测定中性粒细胞吞噬功能。在细菌与外周血混合后，血细胞（中性粒细胞）系统产生两个相互分离的ROS生成峰，即ROS峰Ⅰ和ROS峰Ⅱ。ROS峰Ⅰ在刺激后立即出现，30分钟以内消失，峰值小，伴有耗氧增强；ROS峰Ⅱ在刺激后60分钟左右出现，持续时间可达150分钟以上，峰值明显高于峰Ⅰ，不伴耗氧现象。ROS峰Ⅰ的大小与细菌浓度成正比，其峰值出现时间无明显改变；ROS峰Ⅱ随细菌浓度增加，其峰值出现时间明显提前，峰值逐渐增加。整个历时近300分钟的反应过程中，用辣根过氧化物酶未测出细胞外发光信号，表明整个过程中产生化学发光的中性粒细胞细胞膜通透性无明显变化，其发光反应主要来自细胞内生物化学反应过程。显然，ROS峰Ⅰ和ROS峰Ⅱ具有明显不同的生物学活性，并且代表两类不同功能状态的细胞。用绿脓杆菌等进行的体外实验研究还发现，大鼠全血具有明显的抑菌杀菌作用，此作用与中性粒细胞直接相关，但与血浆成份无直接关系。全血抑菌杀菌过程可分成两个截然不同的阶段，即在ROS峰Ⅰ前期的快速抑菌杀菌期和其后的缓慢抑菌杀菌期。快速抑菌杀菌期中细菌灭活率高达90％左右，此作用在反应开始后3分钟内基本完成。此时，中性粒细胞吞噬细菌的程度并不明显，吞噬细菌中性粒细胞的比例仅占总粒细胞的5％以下，显然，此间的抑菌杀菌现象与中性粒细胞的胞外作用机制有关。在缓慢抑菌杀菌期，中性粒细胞吞噬细菌的作用随反应时间延长而明显增强，在ROS峰Ⅱ之后（反应后200-250分钟），其吞噬率可达30％-60％。吞噬中性粒细胞的比例以及单位粒细胞吞噬细菌的数量随培养时间的延长而增加的程度与反应系统中活菌数量的减少幅度基本相似，因此，中性粒细胞的吞噬及胞内机制可能在缓慢抑菌杀菌期中起着重要的作用。综上所述，我们认为外周血中性粒细胞至少可分为两大种类，即：易被外来物质激活、吞噬和／或消化活性伴随明显耗氧的早期反应中性粒细胞和激活缓慢、吞噬和／或消化活性不伴随耗氧现象的迟缓反应中性粒细胞。在体内抗感染过程中，细胞外作用机制是中性粒细胞抑菌杀菌的重要手段。中性粒细胞吞噬及其相关的细胞内机制主要在于外来异物，例如：病源微生物，的体内清除。本文还对本研究有关中性粒细胞抑菌杀菌机理的实验结果与目前通常认为的作用机理差异的原因进行了讨论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 化学发光及其在生命科学与医学领域中的应用
• 1.1 生物发光及其分类
• 1.2 化学发光原理及特点
• 1.3 化学发光的应用
• 1.3.1 化学发光与高效液相及毛细管电泳技术
• 1.3.2 化学发光在核酸杂交分析中的应用
• 1.3.3 化学发光在蛋白质分析中的应用
• 1.3.4 细胞学检测中的应用
• 1.3.5 化学发光在生物体内活性氧测定中的应用
• 1.3.6 化学发光在被刺激的吞噬细胞中的应用
• 2 呼吸爆发及其机制
• 2.1 呼吸爆发的定义
• 2.2 呼吸爆发的产生机制
• 2.2.1 NADPH氧化酶的活化
• 2.2.2 NADPH氧化酶的组装
• 3 活性氧物质的产生、测定方法及作用
• 3.1 活性氧物质的产生
• 3.2 活性氧物质的测定方法
• 3.3 鲁米诺的增敏作用
• 4 中性粒细胞及其抑菌杀菌机制
• 4.1 中性粒细胞概述
• 4.2 中性粒细胞抑菌杀菌机理
• 4.2.1 蛋白水解酶抑菌杀菌机制
• 4.2.2 活性氧的抑菌杀菌机制
• 4.2.3 NADPH氧化酶协同蛋白水解酶的抑菌杀菌机制
• 5 论文的出发点和主要工作
• 第二章 实验部分
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 主要溶液配方
• 1.3.1 MEM的配制
• 1.3.2 酵母多糖的配制
• 1.3.3 Borate buffer的配制
• 1.3.4 鲁米诺的配制
• 1.3.5 辣根过氧化物酶的配制
• 1.3.6 过氧化氢酶的配置
• 1.3.7 超氧化物歧化酶的配制
• 1.3.8 脂多糖的配制
• 1.3.9 LB液体培养基的配制
• 1.3.10 LB固体培养基的配制
• 2 方法
• 2.1 细菌菌液的制备
• 2.1.1 细菌的过夜（9h-11h）培养
• 2.1.2 菌液的制备
• 2.2 全血的采集
• 2.3 化学发光的检测
• 2.4 温度的设定
• 2.5 鲁米诺浓度的优化
• 2.6 全血量的优化
• 2.7 不同刺激物对化学发光的影响
• 2.8 绿脓杆菌与血浆混合后发光动力学的测定
• 2.9 细菌的培养
• 2.10 白细胞记数
• 2.11 染色
• 2.11.1 涂片
• 2.11.2 染色
• 2.11.3 镜检
• 2.12 氧分压的测定
• 2.13 不同绿脓杆菌量对化学发光的影响
• 2.14 超氧化物歧化酶对酵母多糖和绿脓杆菌刺激大鼠血细胞化学发光的影响
• 2.15 过氧化氢酶对酵母多糖和绿脓杆菌刺激大鼠血细胞化学发光的影响
• 2.16 辣根过氧化物酶对绿脓杆菌刺激大鼠血细胞化学发光的影响
• 2.17 脂多糖对绿脓杆菌刺激大鼠血细胞化学发光的影响
• 2.18 酵母多糖预刺激对绿脓杆菌与大鼠全血混合产生化学发光的影响
• 2.19 粒细胞震荡培养对其受绿脓杆菌刺激产生化学发光反应的影响
• 3 结果
• 3.1 大鼠全血化学发光实验条件的优化
• 3.1.1 鲁米诺浓度的优化
• 3.1.2 全血含量的优化
• 3.2 酵母多糖或细菌刺激大鼠全血中性粒细胞化学发光的特点
• 3.3 细菌刺激大鼠全血中性粒细胞产生发光现象与其抑菌杀菌作用之间的关系
• 3.3.1 大鼠全血化学发光整体过程的抑菌杀菌作用
• 3.3.2 血浆对绿脓杆菌的影响
• 3.3.3 绿脓杆菌刺激大鼠外周血发光过程中不同阶段的抑菌杀菌效率
• 3.3.4 早期化学发光（峰 I 之前）过程中的抑菌杀菌作用
• 3.4 细菌刺激大鼠全血中性粒细胞产生化学发光现象与其吞噬细菌效率的关系
• 3.5 绿脓杆菌刺激大鼠全血产生化学发光不同阶段的生物学特性研究
• 3.5.1 绿脓杆菌刺激大鼠全血产生化学发光与细胞耗氧变化的关系
• 3.5.2 绿脓杆菌浓度对大鼠全血中性粒细胞化学发光的影响
• 3.5.3 峰 I、峰 II化学发光的化学性质分析
• 3.5.3.1 SOD对大鼠全血中性粒细胞化学发光的影响
• 3.5.3.2 Catalase对大鼠全血中性粒细胞化学发光的影响
• 3.5.4 活化中性粒细胞膜通透性研究
• 3.5.4.1 HRP活性测定
• 3.5.4.2 HRP对大鼠全血中性粒细胞化学发光的影响
• 3.5.5 LPS对绿脓杆菌刺激大鼠血细胞化学发光的增敏作用
• 3.5.6 酵母多糖预刺激对绿脓杆菌与大鼠全血混合后化学发光的影响
• 3.6 中性粒细胞体外培养状态对其受绿脓杆菌刺激产生化学发光反应的影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢