论文摘要
目的:催乳素（Prolactin,PRL）是垂体后叶分泌的一种重要的神经内分泌激素,免疫系统是催乳素作用的一个重要的靶点。已经发现催乳素在调节T淋巴细胞介导的免疫应答功能方面起着重要的作用。本文探讨催乳素活化淋巴细胞增殖分化的影响,研究催乳素与免疫细胞活化有关的协同刺激信号之间的关系,以期建立新的淋巴细胞激活途径。方法:细胞培养JurkatE 6-1接种于25ml培养瓶中,用含有体积比为10%小牛血清的RPMI1640培养,细胞调整到终浓度1×106 cells/ml然后接种到48孔板。分抗CD3单抗和抗CD28单抗组、PRL组和抗CD3、CD28单克隆抗体与PRL共刺激组,设立阴性空白对照组作比较。在温度37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养孵化72小时。总RNA提取和RT-PCR用TRIZOL法提取培养细胞总RNA,RT-PCR扩增ZAP-70、LAT和SLP-76中特定的片断。将所合成cDNA作为PCR模板,LAT、SLP-76、ZAP-70和PRL的25ul RT-PCR体系中,引物如下: LAT F-primer: 5’-AGG CTC CTA CGA CAG CAC AT -3’, R-primer: 5’-CAG GTA GCC TGG GTT GTG AT -3’,SLP-76 F-primer: 5’-TGT GCA TCA GAG ACC TTT GC -3’,R-primer:5’-GAC CAG AAA TGT GCC ATC CT -3’,ZAP-70 F-primer: 5’-TGG GGA TGA AGT ACC TGG AG -3’,R-primer: 5’-GCT GGC CAG GCT GTA GTA AC -3’。各反应物量如下10xBV buffer 2.5ul,DMSO 1.5ul,2.5um/ldNTP 2.5ul,β-actin F primer 1.0ul, R primer 1.0ul,Template cDNA 1ul,Water 15ul,Taq 0.5ul。按以下条件进行RT-PCR反应95℃5min,95℃30s,53℃30s,72℃30s,最后7 2℃延长5min。取5μl RT-PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳,与100bp DNA Ladder Marker 5ul直接加入。对照观察结果并拍照。流式细胞术取刺激培养细胞72小时后,收集细胞加入鼠抗人FITC-labeled CD69单克隆抗体,以检测细胞表面CD69表达情况。调节细胞浓度为1X106个·ml-1,取悬液40ul加人测量管中,用冷PBA（等渗磷酸盐缓冲液加2%牛血清蛋白,加0.1%叠氮酸钠）洗涤,避光室温放置15 min,洗涤去未结合单抗固定细胞,上流式细胞仪检测。每个样本计数10000个细胞,获取数据并进行分析比较平均荧光强度（MFI）,输出结果并分析。统计分析:每组实验先取平均值,各组间作成对t-test。P <0.05认为有意义。结果:1.对PRL作用Jurket细胞系增殖反应的结果分析:比较各组结果,抗CD3单抗和抗CD28单抗组与空白对照组相比,吸光度分别为0.422±0.0310和0.403±0.0069,组间t检验比较P <0.05,有统计学差别,说明抗CD3单抗和抗CD28单抗可以活化细胞。而PRL组与空白对照组相比,吸光度分别为0.410±0.0005和0.403±0.0069,组间t检验比较P >0.05,无统计学差别,说明抗PRL不可以单独活化细胞,如果用抗CD3单抗和抗CD28单抗和PRL共刺激,吸光度分别为0.462±0.0081和0.403±0.0069,组间t检验比较P <0.05,有统计学差别,说明抗CD3单抗和抗CD28单抗和PRL共刺激可以充分活化细胞,并引起细胞增殖。2.分析凝胶电泳灰度LAT、ZAP-70、SLP-76、PRL与β-actin的灰度比可知,抗CD3单抗和抗CD28单抗组与空白对照组相比,LAT、ZAP-70、SLP-76与β-actin的灰度比分别为0.427±0.0045、0.563±0.0087、0.461±0.0106和0.419±0.0062、0.525±0.0021、0.432±0.0028,组间t检验比较P <0.05,有统计学差别,说明抗CD3单抗和抗CD28单抗可以活化刺激细胞中LAT、ZAP-70、SLP-76的mRNA的增殖。而PRL组与空白对照组相比,分别为0.422±0.0037、0.526±0.0019、0.440±0.0006和0.419±0.0062、0.525±0.0021、0.432±0.0028,组间t检验比较P >0.05,无统计学差别,说明PRL不可以单独活化刺激细胞中LAT、ZAP-70、SLP-76的mRNA的增殖。如果用抗CD3单抗和抗CD28单抗和PRL共刺激,分别为0.428±0.0025、0.589±0.0083、0.558±0.0057和0.419±0.0062、0.525±0.0021、0.432±0.0028,组间t检验比较P<0.05,有统计学差别,说明抗CD3单抗和抗CD28单抗和PRL共刺激可以充分活化细胞,并引起细胞中LAT、ZAP-70、SLP-76的mRNA的增殖。3.分析Jurkat E6-1细胞CD69表达的平均荧光强度（MFI）,抗CD3单抗和抗CD28单抗组与空白对照组相比,CD69表达的平均荧光强度（MFI）分别为60.61±0.48和3.43±0.05,组间t检验比较P <0.05,有统计学差别,说明抗CD3单抗和抗CD28单抗可以活化细胞,细胞表达CD69分子。而PRL组与空白对照组相比,CD69表达的平均荧光强度（MFI）分别为4.14±0.67和3.43±0.05,组间t检验比较P >大于0.05,无统计学差别,说明影响细胞表达CD69分子没有差别。如果用抗CD3单抗和抗CD28单抗和PRL共刺激,CD69表达的平均荧光强度（MFI）分别为67.09±0.74和3.43±0.05,组间t检验比较P <0.05,有统计学差别,说明抗CD3单抗和抗CD28单抗和PRL共刺激可以充分活化细胞,并引起细胞增殖且细胞表达CD69分子。结论:1.本实验从不同的层面证实可以利用抗CD3和抗CD28单克隆抗体激活免疫细胞JurkatE 6-1。与传统意义上的细胞活化途径有显著的特异性。2.用抗CD3和抗CD28单抗和PRL共刺激,能充分活化淋巴细胞,两者之间存在协同效应机制。3.PRL不能单独活化刺激Jurkat E 6-1细胞增殖。4.发现在抗CD3和抗CD28单克隆抗体激活免疫细胞JurkatE 6-1中存在PRL自分泌现象,其机制有待进一步观察研究。