论文摘要
第一部分非小细胞肺癌A549放射抗拒细胞亚系的建立目的:建立肺癌细胞系A549的放射抗拒模型。方法:应用两种方案对非小细胞肺癌A549细胞系进行X射线照射:一组照射5次,每次剂量600cGy;另一组照射15次,每次剂量200cGy。照射完成后对存活细胞单克隆化,分别命名为A549-S1和A549-S2,采用克隆形成实验测定两种细胞亚系及亲本A549细胞的放射敏感性,流式细胞术检测细胞周期特征。并在放射抗拒亚系形成后三个月再次利用克隆形成实验验证抗拒亚系细胞的放射敏感性。结果:与亲本A549细胞相比,A549-S1细胞显示出明显放射抗性,D0、Dq及N值增大,细胞存活曲线肩区增宽,在SF2水平上,放射抗性是A549的1.38倍,细胞的S期比例较A549细胞明显增高, G0/G1期比例下降（P<0.05）。而A549-S2的放射敏感性与亲本细胞相比稍增强,D0、Dq及N值均减小,细胞存活曲线肩区变窄,在SF2水平上,放射抗性是A549细胞的0.84倍,细胞S期、G0/G1期比例较A549细胞减少,而G2/M期比例明显增加（P<0.05）。三个月后克隆形成实验结果表明,A549-S1细胞仍然显示明显的抗拒性。结论:A549细胞亚系放射抗拒的形成与不同照射方案有一定关系,得出的放射抗拒细胞亚系显示出与亲本不同的细胞周期特征,而且可以稳定传代,保持其放射抗拒性。第二部分Notch1和VEGF在非小细胞肺癌放射抗拒中的作用机制目的:通过研究Notch1基因和VEGF在细胞株A549照射过程中的表达,探讨在A549放射抗拒细胞株形成中Notch信号通路和VEGF的作用。方法:将A549细胞随机分为单纯照射组和照射+VEGF抗体组。照射前利用克隆形成实验检测A549放射敏感性,流式细胞术检测细胞周期特征,RT-PCR和Western Blot技术检测Notch1与VEGF基因和蛋白表达水平。应用X射线分别照射两组A549细胞5次,每次剂量600 cGy。每次照射后24 h检测Notch1与VEGF表达。五次照射完成后单克隆化得到两个细胞亚系A549-S1和A549-S3,检测其放射敏感性和细胞周期特征。利用直线相关分析两实验组Notch1和VEGF表达与照射剂量之间的相关性。结果:A549-S1与A549相比显示出明显放射抗拒性,细胞周期发生了相应变化。Notch1表达与照射剂量成正相关,mRNA和蛋白水平相关系数R分别为0.9288、0.8648（P<0.05）。VEGF表达与照射剂量亦成正相关,mRNA和蛋白水平相关系数R分别为0.9223、0.9233（P<0.05）。Notch1与VEGF表达间也高度相关,mRNA和蛋白水平相关系数分别是0.9041和0.8663（P均<0.05）。.A549-S3放射敏感性和细胞周期特征无明显变化,Notch1表达在照射过程中无显著变化。结论:经过600cGy的5次连续单纯照射得到的A549细胞亚系较A549细胞对射线更加抗拒,显示出与照射之前不同的细胞周期特征,而放射抗拒的形成和细胞周期的变化很可能与VEGF诱导的Notch信号通路激活有关。