AP2/ERF转录因子与水稻产量相关基因LRK6等位基因的表达差异

论文摘要

为了更有效的通过遗传工程的手段进行育种,至关重要的一点就是分析清楚基因的功能及其表达调控。我们实验室先前的工作中,通过图位克隆的方法从以东乡野生稻（Oryza rufipogon Griff.）为供体与以桂朝2号（Oryza sativa L. ssp. Indica）为受体的BC4F2群体中获得了一个与水稻高产有关的QTL位点qGY2-1,实验证明这个QTL位点促进水稻谷粒子增加从而对产量的贡献率达到16%。基因结构分析表明这个QTL位点由LRK1-LRK8 （leucine-rich repeat receptor-like kinase, LRK）,八个编码富含亮氨酸重复序列型类受体激酶新基因所组成的基因簇。有趣的是,我们发现该LRK家族基因在粳稻日本晴（Oryza sativa L. subsp. Japonica var. Nipponbare）和籼稻93-11（Oryza sativa L. subsp. Indica var. 93-11）的杂交后代中存在等位基因表达差异的现象。LRK家族基因中的一员,LRK6基因在籼粳杂交后代中来源不同亲本的等位基因均有表达,但是对于该后代中LRK6基因总转录水平的贡献却不一致。在亲本中,日本晴中的LRK6基因的表达量远远高于93-11中。在籼粳杂交后代中,来源于不同亲本的LRK6等位基因于其在亲本中的表达量相似。这种现象,我们推测是由于等位基因启动子顺式元件所造成的。通过对LRK6启动子的递减分析,我们发现有两个启动子区域对LRK6基因的表达存在明显影响。序列比对分析显示这两个区域的序列在籼稻93-11、粳稻日本晴和东乡野生稻中存在差异。其中一个启动子区域,我们命名为DSLP2 （Different Sequence of LRK6 Promoter 2）,可能具有潜在的转录因子结合位点。使用酵母单杂交的方法,我们获得了一个乙烯响应因子（ERF）蛋白与该片段互作。序列分析和GCC-box互作分析说明,这是一个乙烯响应转录因子基因（OsERF3）,属于ERF家族的第二类转录因子,除含有一个ERF域之外,还有一个具有抑制下游基因表达功能的EAR域。我们通过碱基突变实验确定OsERF3基因与DSLP2区域中的一个未报道的元件（5’-TAA（A）GT-3’）互作。激素处理实验和OsERF3基因过量表达实验结果显示,OsERF3基因可能直接抑制93-11中的LRK6基因的表达,但是对日本晴的LRK6基因的表达没有明显的直接抑制。所有实验的结果综合来看,OsERF3基因,一类乙烯响应的转录因子,与水稻LRK6基因启动子上的元件互作,很有可能导致了籼粳杂交后代中来源不同亲本的等位基因表达差异的现象。为进一步研究水稻产量基因的调控和了解植物杂种优势的机理,做出了一些新的尝试。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词中英文对照
• 第一章 前言
• 1.1 植物启动子的基本结构
• 1.1.1 转录起始位点
• 1.1.2 TATA-box
• 1.1.3 起始因子
• 1.1.4 一般上游元件
• 1.1.4.1 CAAT-box
• 1.1.4.2 GC-box
• 1.2 植物基因启动子的分类
• 1.2.1 组成型启动子
• 1.2.1.1 CaMV 35S启动子
• 1.2.1.2 CsVMV启动子
• 1.2.1.3 Nos和Ocs启动了
• 1.2.1.4 Actin启动子
• 1.2.2 组织特异型启动子
• 1.2.2.1 根特异启动子
• 1.2.2.2 茎特异启动子
• 1.2.2.3 叶特异启动子
• 1.2.2.4 花特异启动子
• 1.2.2.5 果实、种子特异启动子
• 1.2.2.6 维管组织特异启动子
• 1.2.3 诱导型启动子
• 1.2.3.1 光诱导启动子
• 1.2.3.2 温度诱导启动子
• 1.2.3.3 水诱导启动子
• 1.2.3.4 激素诱导启动子
• 1.3 启动子功能研究方法
• 1.3.1 生物信息学分析
• 1.3.2 实验方法分析
• 1.4 启动子研究前景
• 1.5 本研究技术路线
• 第二章 建立以OsPDCD5基因为报告基因的启动子分析策略
• 2.1 材料、试剂及器材
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 主要分子生物学试剂及测序
• 2.1.4 主要化学试剂
• 2.1.5 水稻组织培养的培养基配方
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻DNA大量提取方法
• 2.2.2 LRK6启动子的扩增及分割
• 2.2.3 克隆实验步骤
• 2.2.3.1 PCR扩增产物回收
• 2.2.3.2 T载体连接
• 2.2.3.3 载体转化
• 2.2.3.4 质粒提取
• 2.2.4 植物表达载体的构建
• 2.2.5 基因枪法转化水稻
• 2.2.5.1 愈伤诱导及相关处理
• 2.2.5.2 基因枪转化
• 2.2.6 水稻花粉绒毡层特异启动子驱动OsPDCD5基因转化籼稻93-11
• 2-KI染色法测定花粉活力'>2.2.7 I₂-KI染色法测定花粉活力
• 2.3 结果
• 2.3.1 水稻93-11基因组的提取
• 2.3.2 水稻93-11 LRK6基因启动子的扩增
• 2.3.3 93-11的LRK6基因启动子的连续5'递减分割构建表达载体
• 2.3.4 连续5'递减的LRK6启动子驱动OsPDCD5在转基因水稻中的表达
• 2.3.5 连续5'递减的LRK6启动子驱动OsPDCD5基因不同表型的分析
• 2.3.6 水稻花粉绒毡层特异启动子驱动OsPDCD5基因的研究
• 2.4 讨论
• 第三章 转录因子及其互作的顺势元件的确定
• 3.1 材料
• 3.1.1 水稻材料
• 3.1.2 菌株及载体
• 3.1.3 酵母培养基
• 3.1.3.1 酵母基础培养基
• 3.1.3.2 酵母缺陷培养基
• 3.1.4 主要使用的试剂盒
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 鱼饵质粒的构建
• 3.2.2 水稻总RNA的提取
• 3.2.3 籼稻93-11 cDNA准备
• 3.2.3.1 cDNA第一链的合成
• 3.2.3.2 cDNA的LD-PCR的扩增
• 3.2.3.3 cDNA的纯化
• 3.2.4 酵母感受态的制备
• 3.2.5 酵母转化
• 3.2.6 酵母质粒提取
• 3.2.7 酵母质粒检验及测序
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 鱼饵质粒的确定
• 3.3.2 籼稻93-11 RNA的提取
• 3.3.3 鱼饵质粒的构建及cDNA文库的筛选
• 3.3.4 酵母质粒的提取及扩增鉴定
• 3.3.5 获得一个AP2/ERF转录因了的全序列
• 3.3.6 重复酵母单杂交实验验证互作
• 3.3.7 确定酵母单杂交获得的AP2/ERF蛋白
• 3.3.8 OsERF3基因的功能分析
• 3.3.9 通过分割和突变分析确定LRK6启动子上的顺式元件
• 3.3.10 检测OsERF3蛋白与GCC-box的互作
• 3.4 讨论
• 第四章 OsERF3基因功能及影响LRK6等位基因表达差异的初步研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 激素处理
• 4.1.3 RNA快速微量提取
• 4.1.4 RNA反转录
• 4.1.5 Real Time PCR引物设计
• 4.1.6 Real Time PCR反应及数据处理
• 4.1.7 OsERF3植物表达载体的构建
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 激素处理实验中OsERF3和LRK6的表达
• 4.2.2 植物表达载体pCAMIBIA 1304-OsERF3转化籼稻93-11
• 4.2.3 OsERF3过量表达导致籼稻93-11生长抑制且花粉畸形
• 4.2.4 OsERF3基因对LRK6等位基因表达差异的影响
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间论文发表