NADPH依赖性酶对肿瘤耐药性的影响及细胞内NADPH平衡的分析研究

论文摘要

哺乳动物硫氧还蛋白还原酶（TrxR）,能催化NADPH依赖的硫氧还蛋白（Trx）的还原,参与调节机体氧化还原反应、细胞生长与凋亡等许多重要的生命活动。大量的研究发现TrxR在肿瘤细胞中高表达,与肿瘤的发展和化疗治疗的耐药性密切相关,可能是干预治疗的靶点。我们通过检测白血病敏感（K562）细胞和白血病耐药（K562/ADM）细胞中TrxR的活性,发现TrxR活性在K562/ADM细胞中明显升高。体外实验发现,临床上广泛应用于治疗类风湿性关节炎的药物—金诺芬（Auranofin）作用于K562/ADM细胞24 h,能够显著抑制细胞内TrxR的活性。采用MTT法检测不同浓度金诺芬和阿霉素对K562/ADM细胞生长抑制的影响,分别以0.25、0.5、1、2和3μM金诺芬和阿霉素作用K562/ADM细胞6h后,阿霉素用药组其细胞存活率下降0%、1.1%、7.9%、3.9%和6.6%,而金诺芬用药组明显地依次下降22.8%、34%、52.9%、67%和81.3%；随着药物作用时间延长至24 h和48 h,与阿霉素用药组相比,金诺芬用药组的细胞数目显著性地呈时间依赖性地减少。采用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）分析细胞凋亡率和凋亡相关caspase-3蛋白表达,结果显示3μM金诺芬作用K562/ADM细胞24 h的凋亡率增加24.6%,明显高于阿霉素用药组（4.8%,与金诺芬用药组比较P<0.05）；当1μM金诺芬作用K562/ADM细胞12 h,Caspase-3表达增加53%,而阿霉素用药组仅增加4.5%（与金诺芬用药组比较P<0.05）。因此,TrxR抑制剂—金诺芬能够抑制细胞内TrxR的活性,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡和上调Caspase-3表达,可能是逆转人白血病多药耐药治疗的干预药物。NADPH作为一种辅酶,参与多种合成代谢反应,是细胞内重要的供氢体,可保护细胞不受氧化伤害。它主要由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、苹果酸酶（ME）和异柠檬酸脱氢酶（IDH）通过各自的生化反应所提供。这三种酶分别是磷酸戊糖途径、丙酮酸循环和三羧酸循环的关键酶。为探讨影响胞内NADPH的平衡与G6PD、ME和IDH之间的关系,我们使用RNAi技术成功地建立了G6PD-knockdown A549细胞株,其G6PD活性只有对照细胞的十分之一。通过高效液相色谱（HPLC）分析对照细胞和G6PD-knockdown A549细胞内的NADPH水平,发现两者无显著性差异。应用蛋白质组学技术—同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）标记结合二维液相色谱—串联质谱（2D-LC-MS/MS）对两株细胞内整体蛋白质的表现进行比较,共鉴定到置信度在95%以上的蛋白质有1760种,提供NADPH的酶有7种。发现正常培养情况下,其中细胞质NADP’依赖性异柠檬酸脱氢酶（IDPc）的表达随着G6PD的下降增加1.33倍,而ME的表达没有改变。以Western blot和活性测试进一步验证发现,IDPc的表达在G6PD-knockdown A549细胞内明显增加,其活性是对照细胞的1.55倍,而ME的表达和活性无显著性差异。由此,推论在G6PD缺乏的情况下,细胞通过上调IDPc的表达而不是ME来维持其NADPH/NADP+的平衡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 TrxR抑制剂—金诺芬诱导K562/ADM细胞凋亡
• 前言
• 1. 白血病的多药耐药性
• 2. 白血病多药耐药的形成机制与氧化还原态
• 2.1 白血病多药耐药性的形成机制
• 2.1.1 通过膜转运蛋白介导的药物外排泵途径
• 2.1.2 通过酶介导的途径
• 2.1.3 通过调节细胞凋亡的途径
• 2.2 氧化还原态
• 2.3 氧化还原态与多药耐药机制
• 2.3.1 氧化还原态与多药耐药转运体构象的改变
• 2.3.2 氧化还原态与MRP活性的改变
• 2.3.3 氧化还原态与P-gp表达的改变
• 2.3.4 氧化还原态与p53基因
• 3. TrxR与肿瘤及多药耐药的治疗
• 3.1 TrxR的结构及活性
• 3.2 TrxR是肿瘤治疗的靶点
• 3.3 TrxR是多药耐药的新靶点
• 材料与方法
• 1. 主要试剂和仪器
• 2. 细胞培养
• 3. MTT法检测金诺芬对细胞的增值抑制作用
• 4. 测定TrxR活性
• 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 6. Caspase-3表达检测
• 7. 统计学分析
• 实验结果
• 1. 与敏感细胞相比,耐药K562/ADM细胞中TrxR活性显著增高
• 2. 金诺芬抑制K562/ADM细胞中TrxR活性
• 3. MTT法检测金诺芬对K562/ADM细胞增殖的影响
• 4. 细胞凋亡检测
• 5. Caspase-3蛋白表达变化
• 讨论
• 结论
• 第二部分 蛋白质组学技术探讨G6PD和NADP（+）依赖性异柠檬酸脱氢酶与NADPH平衡的关系研究
• 前言
• 1. G6PD研究进展
• 1.1 G6PD基因及其突变型
• 1.2 G6PD在细胞内扮演的角色
• 1.2.1 G6PD与细胞生长和衰老
• 1.2.2 G6PD与病毒感染
• 1.3 G6PD与人类疾病
• 2. G6PD与NADPH平衡
• 2.1 NADPH
• 2.2 产生NADPH酶类
• 2.3 NADPH的平衡与产生NADPH酶类
• 2.4 G6PD与产生NADPH的酶
• 材料与方法
• 1. 主要试剂和仪器
• 2. 细胞培养
• 3. G6PD活性测试
• 4. NADPH量的测定
• 5. iTRAQ实验及分析
• 6. 异柠檬酸脱氢酶和苹果酸酶的活性测试
• 7. Western blot-G6PD、ME1、ME3、IDPc和IDPm的表达
• 8. 统计分析
• 实验结果
• 1. 与对照细胞相比,G6PD的活性和表达在G6PD-knockdown A549细胞中明显下降
• +比值在G6PD-knockdown A549细胞中不变'>2. 与对照细胞相比,NADPH/NADP⁺比值在G6PD-knockdown A549细胞中不变
• 3. 通过iTRAQ分析,应用LIBRA program对细胞内几乎所有产生NADPH的酶进行定量
• 4. 与对照细胞相比,IDPc活性在G6PD-knockdown A549细胞中明显增加
• 5. 与对照细胞相比,ME活性在G6PD-knockdown A549细胞中无明显变化
• 6. 与对照细胞相比,IDPc的表达在G6PD-knockdown A549细胞中明显增加
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢
• 缩略词表