论文摘要
脑缺氧导致严重的细胞变性,因而脑功能丧失。当前普遍认为,缺氧主要导致谷氨酸大量释放和细胞内过量的Ca2+蓄积,从而引起神经元死亡。钠泵又称Na+, K+-ATP酶,是一种膜结合蛋白,可通过水解一分子ATP将三个Na+转运到细胞外同时摄取两个K+进入细胞,产生电化学梯度,维持细胞渗透压平衡和静息电位,因此钠泵是维持Na+动态平衡、体液和电解质稳态的关键。当哺乳动物脑组织的氧或血流供应低于临界值时就会出现能量障碍,仅仅缺氧5 min时则ATP将下降90%,而当ATP丢失50～60%时钠泵活性就会下降,使细胞膜去极化进而钠和水进入细胞内。去极化使电压门控性钙通道开放Ca2+内流,同时崩塌的Na+梯度引起Na+依赖性谷氨酸转运体排除谷氨酸到细胞间隙,激活谷氨酸受体导致大量Ca2+内流,继而出现Ca2+依赖性细胞损伤。由此可见,钠泵在脑缺血的发生、发展过程中起着重要的作用。但目前对钠泵的研究大多数集中在心肌细胞、肾脏、骨骼肌、血管平滑肌,而对脑组织钠泵的分布及功能特性研究较少,特别是其在脑缺血、缺氧状态下,功能和特性的改变及其可能机制的研究甚少,本研究旨在选取对缺血较敏感的皮层神经元（Ⅴ和Ⅵ层锥体细胞）,研究钠泵电生理特性及其在缺氧中的改变,并探讨其可能机制。一、大鼠皮层大锥体细胞钠泵的电生理特性目的:应用脑片皮层神经元研究钠泵电流的特性。方法:选取出生1316天SD大鼠,深度麻醉后断头,快速取出脑组织放入冰冷的人工脑脊液（ACSF）中,取前脑切成300μm的薄片,储存在95%O2+5%CO2饱和的ACSF中。然后将制备好的皮层脑片放置于灌流槽中,持续灌流95% O2和5% CO2饱和的ASCF,流速为1～2ml/min,使脑片浸没于液面下。在红外微分干涉相差显微镜下,移动电极至细胞上方负压吸引形成封接,再以负压吸破细胞膜,使电极内液与细胞内液相通,并将细胞钳制在-65mV,当膜电流稳定时,先通过膜去极化程序（-65mV—0mV—-65mV）激活Na+电流来鉴别正在记录的细胞是神经元,然后换为含不同浓度哇巴因（Oua,10-10～10-3 mol/L）的灌流液,以全细胞膜片钳方式记录皮层神经元钠泵电流,并以10-3 mol/L Oua产生的泵电流幅度为100%,计算各浓度Oua产生的泵电流（IP）的变化率（ΔIP）,并以此为纵坐标,以Oua浓度（[Oua]）为横坐标,绘制ΔIP-[Oua]关系曲线。整个实验在室温下进行结果:10-3 mol/L Oua引起的膜电流内向移动幅度与切换无K+细胞外液所致的膜电流内向移动幅度相同,证明该Oua敏感性电流为钠泵电流。本研究在53个神经元测定了泵电流,根据神经元钠泵对10-8 mol/L Oua的反应,可将钠泵电流对Oua（10-10～10-3 mol/L）的ΔIP-[Oua]关系曲线分为兴奋、抑制和无作用三种模式。三部分细胞的Na+电流、细胞直径和电容没有差异,均为皮层五六层大锥体细胞。在兴奋模式ΔIP-[Oua]关系曲线,10-10～10-3 mol/L Oua所对应的ΔIP值分别是-0.014±0.042、-0.049±0.071、-0.067±0.099、-0.111±0.063、-0.141±0.089、-0.300±0.067、-0.437±0.094、-0.690±0.106和-1.000±0.000。其ΔIP-[Oua]关系曲线呈三位点结合特征,采用双亚基三位点结合模型可进行最优拟合,包括高亲和力兴奋性位点、高亲和力抑制性位点和低亲和力抑制性位点,其解离常数分别为1.391 nmol/L、8.506 nmol/L和216.1μmol/L。在抑制模式ΔIP-[Oua]关系曲线,10-10～10-3 mol/LOua所对应的ΔIp值分别是0.016±0.063、0.042±0.089、0.065±0.107、-0.071±0.100、-0.135±0.042、-0.272±0.059、-0.467±0.078、-0.638±0.038和-1.000±0.000。其IP-[Oua]关系曲线呈两位点结合特征,采用双位点结合模型可进行最优拟合,包括高亲和力抑制性位点和低亲和力抑制性位点,其解离常数分别为60.46 nmol/L和202.32μmol/L。在无作用模式ΔIP-[Oua]关系曲线,10-1010-7 mol/L Oua对钠泵电流几乎无作用,10-6～10-3 mol/L Oua剂量依赖性抑制钠泵电流。其ΔIP-[Oua]关系曲线呈单位点结合特征,采用单位点结合模型可进行最优拟合,仅包括低亲和力抑制性位点,其解离常数为198.2μmol/L。综合以上三种模式,高亲和力钠泵电流占总泵电流的19.6～20.0%,可能经α2或α3亚基介导,而低亲和力钠泵电流占总泵电流的80.0～80.4%,可能经α1亚基介导。结论:皮层的锥体神经元表达两种功能不同的钠泵,即高亲和力钠泵和低亲和力钠泵。二、钠泵参与了大鼠皮层大锥体细胞的缺氧性损伤目的:比较皮层神经元高亲和力钠泵和低亲和力钠泵在缺氧损伤中的作用。方法:通过无糖低氧液体孵育皮层脑片或者培养的皮层神经元来造成糖氧分离的模型,采用TTC染色评价缺氧0、5、10和15 min对皮层脑片神经元活性的影响,采用缺氧后皮层脑片大锥体细胞膜电流密度的改变（?I/Cm）以及培养皮层神经元内Ca2+浓度([Ca2+]i)的改变（?Ratio）来评价神经元缺氧损伤的程度。钠泵对缺氧所致皮层脑片神经元膜电流变化的影响:采用Oua 10 nmol/L兴奋或者抑制高亲和力钠泵,以及Oua 10μmol/L抑制低亲和力钠泵后,检测缺氧0、2、4、6、8和10 min时的?I/Cm。钠泵对缺氧所致皮层脑片神经元[Ca2+]i变化的影响:采用可视化动缘探测系统检测培养的皮层神经元[Ca2+]i和Na+浓度（[Na+]i）荧光信号（Fura-2 10μmol/L和SBFI 10μmol/L）,①连续灌流含Oua（10-9～10-3 mol/L）的正常细胞外液2 min,测定[Ca2+]i和[Na+]i ?Ratio。②以Oua 10 nmol/L和10μmol/L正常细胞外液预先处理皮层神经元,然后换为含有相同浓度Oua的低氧细胞外液,连续记录10 min,测量0、2、4、6、8和10 min的?Ratio。缺氧对总钠泵电流的影响:缺氧400s或600s后,给予10-3 mol/L Oua比较皮层脑片大锥体细胞的钠泵电流密度。结果:TTC染色结果表明,缺氧脑片活性较正常脑片明显降低（P<0.01）,缺氧5min下降到正常的72.6%,缺氧10 min下降到正常的67.3%,缺氧15 min下降到正常的65.2%,然而在缺氧5、10和15 min之间互相比较则无明显改变（P>0.05）。正常条件下,离体皮层脑片大锥体细胞膜电流水平在10 min内几乎维持不变,但给予低氧灌流液10 min,神经元膜电流则逐渐增大,在缺氧0、2、4、6、8和10 min时,其?I/Cm分别为0、-0.015±0.006、-0.026±0.011、-0.031±0.016、-0.041±0.010和-0.055±0.014 pA/pF,呈时间依赖性升高（r=0.991,P<0.01）,缺氧4 min时膜电流即显著增大（P<0.01）。单纯缺氧可明显升高大锥体细胞[Ca2+]i,且呈时间依赖性（r=0.973,P<0.01）,缺氧0、2、4、6、8和10 min时的ΔRatio值分别为0、0.019±0.001、0.048±0.006、0.089±0.008、0.130±0.015和0.165±0.008,与缺氧0min比较,4、6、8和10min有明显差异（P<0.05或0.01）。给予Oua 10μmol/L后大锥体细胞膜电流明显增大（P<0.01）,此时再缺氧10 min可使膜电流进一步呈时间依赖性增大（r=0.9082,P<0.01）,于缺氧2、4、6、8和10 min时?I/Cm即明显大于缺氧前（0 min）（P<0.05或0.01）,也明显大于单纯缺氧各时间点（P<0.05或0.01）。但在具有高亲和力兴奋性位点的大锥体细胞,给予Oua 10 nmol/L后再缺氧2、4、6、8和10min,其?I/Cm较缺氧前（0min）均无明显改变,与单纯缺氧各时间点比较,缺氧4、6、8和10 min时其?I/Cm的增加程度也明显减小（P<0.05或0.01）,表明高亲和力钠泵兴奋,可保护皮层神经元对抗缺氧性损伤。而在仅具有高亲和力抑制性位点的大锥体细胞,给予Oua 10 nmol/L后再缺氧10 min可使膜电流进一步呈时间依赖性逐渐增大（r=0.956,P<0.01）,缺氧2、4、6、8和10min,?I/Cm分别较缺氧前（0min）明显增大（P<0.01）,与单纯缺氧各时间点比较,缺氧4、6、8和10 min时其?I/Cm增加的程度一致（P>0.05）,表明高亲和力钠泵抑制并不影响皮层大锥体细胞的缺氧损伤。若将此两组细胞综合在一起统计,可发现Oua 10 nmol/L仍然对缺氧损伤有明显的保护作用,与单纯缺氧各时间点比较,缺氧8和10 min时其?I/Cm增加的程度明显减小（P<0.05或0.01）。有氧状态下,不同浓度的Oua可剂量依赖性显著升高皮层神经元[Na+]i（r=0.939, P<0.01）和[Ca2+]i（r=0.984,P<0.01）。当Oua的浓度为10-5～10-3mol/L时,[Na+]i的ΔRatio值显著增加,分别为0.017±0.004、0.030±0.004和0.035±0.004（P<0.01）;当Oua的浓度为10-7～10-3mol/L时,[Ca2+]i的ΔRatio值显著增加,分别为0.056±0.013、0.107±0.018、0.158±0.011、0.185±0.016和0.192±0.014（P<0.05或P<0.01）,提示抑制钠泵升高[Ca2+]i。在10 nmol/L Oua存在的情况下,缺氧4、6、8和10min较缺氧前（0min）[Ca2+]i显著升高（P<0.05或0.01）,但缺氧10min时其[Ca2+]i升高的程度明显低于单纯缺氧（P<0.05）。在Oua 10μmol/L存在的情况下,缺氧后各时间点的[Ca2+]i与单纯缺氧各相应时间点比较,升高的程度也显著增加（P<0.05或0.01）。离体皮层脑片分别缺氧400和600 s后,钠泵电流密度明显降低（P<0.01）,但是缺氧400s和600s比较差别不明显（P>0.05）。离体皮层脑片分别缺氧400和600 s后,钠泵电流密度明显降低（P<0.01）,但是缺氧400s和600s比较差别不明显（P>0.05,Fig.8）。结论:缺氧使皮层五六层大锥体细胞膜电流增加以及[Ca2+]i升高。不同程度阻断钠泵功能可通过升高皮层大锥体细胞[Na+]i水平影响[Ca2+]i。兴奋高亲和力钠泵对皮层大锥体细胞的缺氧损伤有保护作用。阻断低亲和力钠泵,促进了皮层大锥体细胞缺氧损伤程度。三、ATP和H2O2对正常或缺氧神经元钠泵的影响目的:研究皮层大锥体细胞缺氧损伤中,ATP和H2O2对高、低亲和力钠泵的影响。方法:ATP对钠泵的影响:将脑片分为两组,一组使用正常电极内液,一组使用无ATP电极内液,每组脑片再分成两部分,一部分脑片灌流有Oua（从低浓度到高浓度10-1010-3mol/L）的正常灌流液,计算钠泵电流的大小（IP）;另一部分脑片先给予低氧灌流液200 s,再切换为含有Oua（10-1010-3 mol/L）的低氧灌流液200 s,计算钠泵电流的大小（IP’）。以10-3 mol/L Oua测定的IP或IP’作为1,绘制量效曲线。因此总共4组,分别称为control-ATP、hypoxia-ATP、control-no ATP和hypoxia-no ATP。H2O2对钠泵的影响:先给予含100或300μmol/L H2O2的灌流液200 s,再切换为同时含H2O2和Oua（10-1010-3 mol/L）的灌流液到平衡,两部分细胞分别以10-3 mol/L Oua测定的IP为1,绘制量效曲线。钠泵α亚基转位:脑片缺氧10 min或者分别用100或300μmol/L的H2O2孵育10 min,提取总蛋白和膜蛋白,采用western blot方法观察细胞膜钠泵蛋白水平的改变。结果:在无ATP存在的情况下,缺氧400和600 s后,可显著降低钠泵电流密度（IP/Cm）,从常氧0.365±0.072 pA/pF分别下降到0.282±0.025和0.272±0.044 pA/pF（P<0.01）。在hypoxia-no ATP组,Oua所引起的IP/Cm较control-no ATP组显著降低（p<0.05或0.01）,提示神经元内ATP耗竭时,缺氧可以同时抑制高亲和力和低亲和力钠泵的离子转运功能。对两组IP-[Oua]量效曲线进行拟合,hypoxia-no ATP组中高亲和力抑制性结合位点的解离常数为0.1471 nmol/L,较control-no ATP组的0.1732 nmol/L降低,是其84.93%,而低亲和力抑制性结合位点的解离常数为170.9μmol/L,较control-no ATP的134.7μmol/L明显升高,是其1.269倍。另外,hypoxia-no ATP组的高亲和力钠泵在总钠泵电流中所占的比例显著升高,为20.53%,是control-no ATP组（13.47%）的1.52倍,而低亲和力钠泵所占比例下降,为79.47%是control-no ATP（86.53%）的91.84%,提示在无ATP条件下,缺氧可提高高亲和力钠泵的构成比例及其对Oua的敏感性。而在ATP充足的条件下,分别缺氧400和600 s后,IP/Cm均无明显降低（P>0.05）。在hypoxia-ATP组,10-10～10-3 mol/L Oua所引起的IP/Cm改变与control-ATP组比较不明显（p>0.05）。对两组IP-[Oua]量效曲线进行拟合,hypoxia-ATP组中高亲和力抑制性结合位点和低亲和力抑制性结合位点的解离常数分别为0.2888 nmol/L和91.94μmol/L,均低于control-ATP组二者（95.38 nmol/L和147.6μmol/L）分别为后者的0.303%和62.29%。另外,在hypoxia-ATP组,高亲和力钠泵在总钠泵电流中所占的比例为15.88%,低亲和力钠泵为84.12%,而在control-ATP组,二者分别为12.49%和87.51%,是hypoxia-ATP的1.211倍和0.9601。提示缺氧可提高高亲和力钠泵的构成比例和两种钠泵对Oua的敏感性,其中高亲和力钠泵的改变更为显著。control-no ATP与control-ATP比较10-8、10-5、10-4和10-3 mol/L Oua所致IP/Cm明显减小（p<0.05或p<0.01）,control-no ATP与hypoxia-ATP比较10-5、10-4和10-3 mol/L Oua所引起的IP/Cm明显减小（p<0.01）,hypoxia-no ATP与hypoxia-ATP比较10-8、10-6、10-5、10-4和10-3 mol/L Oua所引起的IP/Cm明显减小（p<0.01）,说明ATP耗竭主要抑制了低亲和力钠泵的离子转运功能。根据拟合曲线,可以看出高、低亲和力钠泵对Oua的亲和力也相应改变,4组中hypoxia-no ATP组高亲和力钠泵解离常数最小,control-ATP是其的648倍,说明其结合Oua的能力最强,hypoxia-no ATP低亲和力钠泵解离常数最大,说明其结合Oua的能力最弱。提示神经元内ATP含量越少其高亲和力钠泵对Oua的亲和力越高,而高亲和力钠泵对Oua的亲和力越低。与对照组比较给予H2O2 100μmol/L对10-10～10-3 mol/L Oua所引起的IP/Cm影响不明显（p<0.05）,但H2O2 300μmol/L对IP/Cm有明显的抑制作用,与对照比较各个浓度Oua所引起的IP/Cm均减小的趋势,10-6、10-5和10-3 mol/L Oua时明显减小（p<0.05或p<0.01）。将3组细胞高亲和力钠泵和低亲和力钠泵各自的IP/Cm分开,H2O2300μmol/L显著抑制高亲和力钠泵的功能（p<0.01）,而对低亲和力钠泵影响不明显。对量效曲线进行拟合,随H2O2浓度的增加,高亲和力钠泵的解离常数明显减小,H2O2 100μmol/L存在的条件下高亲和力钠泵解离常数为0.2125 nmol/L,是对照（95.38nmol/L）的0.22%,给予H2O2 300μmol/L时高亲和力钠泵解离常数为0.0582 nmol/L,是对照组0.6102‰,提示H2O2显著提高了高亲和力钠泵对Oua的敏感性。H2O2对低亲和力钠泵的作用较高亲和力钠泵轻,但作用趋势相似,H2O2100μmol/L存在的条件下低亲和力钠泵解离常数为87.32μmol/L,是对照（147.6μmol/L）的59.2%,给予H2O2300μmol/L时低亲和力钠泵解离常数为58.21μmol/L,是对照组39.4%,提示H2O2提高了低亲和力钠泵对Oua的敏感性。神经元在H2O2作用下,其高、低亲和力钠泵在总钠泵中的构成比例也同样有明显改变,对照组高亲和力钠泵占12.4%,低亲和力钠泵占87.6%,给予H2O2100μmol/L时二者分别为10.8%和89.2%,而给予给予H2O2 300μmol/L时二者分别为3.3%和96.7%。皮层脑片在低氧灌流液中孵育10 min,总蛋白中3种α亚基水平均无明显改变,但是膜蛋白中α3亚基在缺氧后蛋白水平为0.672±0.041较对照组0.472±0.060有明显升高（p<0.01）,α1和α2亚基并没有明显改变（p>0.05）。脑片在H2O2100和300μmol/L作用下,与对照组比较总蛋白和膜蛋白中3种α亚基水平均无明显改变（p>0.05）。结论:ATP匮乏主要抑制低亲和力钠泵的离子转运功能,对高亲和力钠泵的影响不明显。活性氧主要抑制高亲和力钠泵的离子转运功能,对低亲和力钠泵的影响不明显。ATP匮乏和外源性活性氧均能够显著的提高高亲和力钠泵对Oua的敏感性。缺氧10min,高亲和力钠泵在总钠泵中所占比例明显提高,以及α3亚基由胞浆向胞膜移位。