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鹅白细胞介素-2成熟蛋白基因表达及其免疫佐剂效应的研究

2020-12-01阅读(189)

鹅白细胞介素-2成熟蛋白基因表达及其免疫佐剂效应的研究

论文摘要

根据本实验室在GenBank中注册的四川白鹅白细胞介素2（GoIL-2）基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,对GoIL-2基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析后,开展GoIL-2基因原核表达载体构建和表达产物纯化、表达产物生物学活性检测、表达产物对小鹅瘟弱毒疫苗和VP3基因工程重组亚单位疫苗的佐剂效应研究,获如下结果:1 GoIL-2原核表达、产物纯化和生物学活性PCR扩增GoIL-2成熟蛋白基因并克隆到pMD18-T载体,测序鉴定后将其连接到原核表达载体pET32a+,转化宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。结果,表达出大小约34KD重组GoIL-2蛋白,以可溶性形式存在,占菌体总蛋白的42.5%。重组蛋白经镍金属螯合介质填料（Ni+-MIAC）后得到纯化,复性后用MTT法检测表达产物的相对生物学活性单位为110672U/mg。2重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫青年鹅佐剂效应研究重组GoIL-2以500U/只、1000U/只、2000U/只分别与小鹅瘟VP3基因16抗原决定簇重组亚单位工程疫苗（Ag16v）、小鹅瘟VP3基因10抗原决定簇重组亚单位工程疫苗（Ag10v）和GPV弱毒疫苗同时免疫青年鹅,分为12组:500U+Ag16v、1000U+Ag16v、2000U+Ag16v、500U+Ag10v、1000U+Ag10v、2000U+Ag10v、1000U+GPV,同时设Ag16v对照组、Ag10v对照组、GPV弱毒对照组、IL-2对照组、PBS对照组。（1）细胞免疫:免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d采血,用MTT法检测青年鹅细胞免疫水平。结果:试验组鹅外周血中T淋巴细胞转化率于7-49d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于PBS对照组。①2000U+Ag16v组,14-49d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag16v对照组和500U+Ag16v组,于21-28d显著（P＜0.05）高于1000U+Ag16v组。500U+Ag16v组与Ag16v对照组差异不显著（P＞0.05）。②2000U+Ag10v组,14-49d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag10v对照组和500U+Ag10v组,于21-28d显著（P＜0.05）高于1000U+Ag10v组。500U+Ag10v组与Ag10v对照组差异不显著（P＞0.05）。③1000U+GPV组,14-28d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于GPV对照组。结果表明GoIL-2能够增强小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗和GPV弱毒疫苗诱导的细胞免疫应答,且具有一定的剂量依赖性。（2）体液免疫:免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d采血,用ELISA法和中和抗体试验检测青年鹅体液免疫水平。结果:①ELISA抗体:试验组于7-175d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于PBS对照组、IL-2对照组。2000U+Ag16v组于14-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag16v对照组和500U+Ag16v组,于21-28d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于1000U+Ag16v组。500U+Ag16v组与Ag16v对照组差异不显著（P＞0.05）。2000U+Ag10v组于14-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag10v对照组、500U+Ag10v组,于21d、49d、77d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于1000U+Ag10v组。500U+Ag10v组与Ag10v对照组差异不显著（P＞0.05）。1000U+GPV组,于21d时达到峰值,于14-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于GPV弱毒疫苗对照组。②中和抗体:试验组、对照组（除PBS对照组、IL-2对照组）都产生了特异性GPV抗体。2000U+Ag16v组21-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于500U+Ag16v组和Ag16v对照组,21-35d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于1000U+Ag16v组。500U+Ag16v组与Ag16v对照组差异不显著（P＞0.05）。2000U+Ag10v组于14-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag10v对照组和500U+Ag10v组,于21d、28d极显著（P＜0.01）高于1000U+Ag10v组。500U+Ag10v免疫组中和抗体效价与Ag10v对照组差异不显著（P＞0.05）。1000U+GPV组21-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于GPV弱毒疫苗对照组。体液免疫试验表明重组GoIL-2能够增强小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗和GPV弱毒疫苗诱导的体液免疫应答,且具有一定的剂量依赖性。3重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫开产前种鹅佐剂效应研究重组GoIL-2以6000U分别与GPV弱毒疫苗、Ag16v和Ag10v免疫种鹅,同时设Ag16v对照组、Ag10v对照组、GPV弱毒对照组、IL-2对照组、PBS对照组,免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d各组随机采集种鹅血、收集种蛋进行血清和卵黄抗体检测,同时孵化种蛋以100个LD50GPV-CHv强毒株对后代雏鹅进行攻毒保护试验。结果:（1）血清ELISA抗体:试验组于7-175d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于PBS对照组、IL-2对照组。6000U+Ag16v、6000U+Ag10v和6000U+GPV免疫组,7-147d分别极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag16v、Ag10v和GPV对照组。（2）血清中和抗体:试验组、对照组（除PBS对照组、IL-2对照组）都产生了特异性GPV抗体。6000U+Ag16v、6000U+GPV免疫组,21-147d分别极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag16v、GPV对照组。6000U+Ag10v,14-147d极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag10v对照组。（3）卵黄ELISA抗体:6000U+Ag16v、6000U+Ag10v和6000U+GPV免疫组,7-147d分别极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag16v、Ag10v和GPV对照组。（4）卵黄中和抗体:试验组和对照组（除PBS对照组、IL-2对照组）都产生了特异性GPV抗体。其中IL-2+Ag16v、IL-2+Ag10和IL-2+GPV免疫组抗体的中和效价于21-147d分别极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）高于Ag16v、Ag10v和GPV对照组。表明重组GoIL-2增强了小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗和GPV弱毒疫苗诱导的种鹅血清和卵黄抗体水平。（5）攻毒保护率:Ag16v+IL-2、Ag10v+IL-2、GPV+IL-2于21d达到100%保护率持续至161d,175d时对后代雏鹅的保护率分别降到80%、80%、90%,对后代雏鹅的免疫保护期达140d,而Ag16v、Ag10v、GPV对照组于28d达到100%保护率分别持续至147d、147、161d,对后代雏鹅的免疫保护期分别为119d、119、133d。试验组其后代雏鹅免疫保护期较对照组长7-21d,表明重组GoIL-2能够提高小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗和GPV弱毒疫苗免疫种鹅后对其后代雏鹅的攻毒保护率。

论文目录

  • 本论文的创新性研究工作
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一部分 文献综述及选题目的意义
  • 第一章 白细胞介素2的研究进展
  • 1 IL-2基因及其编码蛋白的分子结构
  • 2 IL-2蛋白的生物学活性
  • 3 IL-2的活性检测
  • 4 IL-2的化学修饰
  • 5 IL-2在兽医中的应用
  • 5.1 IL-2蛋白作为免疫佐剂
  • 5.2 IL-2基因作为免疫佐剂
  • 5.3 IL-2蛋白作为免疫治疗剂
  • 6 选题目的和意义
  • 第二部分 试验研究
  • 第二章 GOIL-2基因在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
  • 1 材料
  • 1.1 菌株、毒株及质粒
  • 1.2 主要药品及试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 GoIL-2成熟片段的克隆、测序
  • 2.1.1 引物设计
  • 2.1.2 GoIL-2成熟片段基因的PCR扩增
  • 2.2 GoIL-2成熟蛋白基因表达载体的构建
  • 2.2.1 DH5α感受态细胞的制备
  • 2.2.2 GoIL-2成熟片段基因的克隆和鉴定
  • 2.2.3 GoIL-2成熟片段基因原核表达质粒的构建及酶切鉴定
  • 2.3 GoIL-2成熟片段基因在大肠杆菌中的表达及表达形式分析
  • 2.4 重组GoIL-2基因工程菌表达条件的优化
  • 2.5 重组GoIL-2蛋白的纯化
  • 2.6 重组GoIL-2蛋白的透析
  • 2.7 MTT法检测重组GoIL-2蛋白生物学活性
  • 2.7.1 淋巴细胞悬液制备
  • 2.7.2 重组GoIL-2蛋白相对生物活性的测定
  • 3 结果
  • 3.1 GoIL-2基因的PCR扩增
  • 3.2 GoIL-2基因的克隆和鉴定
  • 3.3 GoIL-2基因原核表达质粒的构建及鉴定
  • 3.4 GoIL-2基因在大肠杆菌中的表达及表达形式分析
  • 3.5 重组GoIL-2基因工程菌表达条件的优化结果
  • 3.5.1 诱导时间对表达的影响
  • 3.5.2 IPTG浓度对表达的影响
  • 3.5.3 诱导温度对表达的影响
  • 3.6 重组蛋白过柱纯化
  • 3.7 重组GoIL-2蛋白生物活性测定
  • 4 讨论
  • 4.1 GoIL-2基因原核表达质粒的构建
  • 4.2 重组GoIL-2表达条件的优化
  • 4.3 重组GoIL-2蛋白活性检测
  • 第三章 重组GOIL-2对小鹅瘟病毒VP3基因亚单位工程疫苗、GPV弱毒疫苗免疫青年鹅佐剂效应研究
  • 1 材料
  • 1.1 菌、毒株及质粒
  • 1.2 试验动物
  • 1.3 主要药品及试剂
  • 1.4 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 重组GoIL-2蛋白佐剂的制备
  • 2.2 动物试验分组免疫
  • 2.3 血样采集
  • 2.4 MTT法检测鹅外周血T淋巴细胞增殖效果
  • 2.5 间接ELISA法检测鹅血清抗体IgG的动态变化
  • 50测定'>2.6 GPV CHv强毒株TCID50测定
  • 2.7 待检血清样品的制备及微量病毒中和试验
  • 3 结果
  • 50测定'>3.1 GPV CHv强毒株TCID50测定
  • 3.2 动物试验结果
  • 3.2.1 不同剂量重组GoIL-2蛋白与小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫后鹅外周血T淋巴细胞增殖效果
  • 3.2.2 不同剂量重组GoIL-2蛋白与小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫后血清抗体IgG的动态变化
  • 3.2.3 不同剂量重组GoIL-2与小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫后鹅血清抗体中和效价动态变化
  • 3.2.4 不同剂量重组GoIL-2蛋白与小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫后鹅外周血T淋巴细胞增殖效果
  • 3.2.5 不同剂量重组GoIL-2蛋白与小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫后鹅血清抗体IgG的动态变化
  • 3.2.6 不同剂量重组GoIL-2与小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫后鹅血清抗体中和效价动态变化
  • 3.2.7 重组GoIL-2蛋白与GPV弱毒疫苗免疫后鹅外周血T淋巴细胞增殖效果
  • 3.2.8 重组GoIL-2蛋白与GPV弱毒疫苗免疫后血清抗体IgG的动态变化
  • 3.2.9 重组GoIL-2蛋白与GPV弱毒疫苗免疫后鹅血清抗体中和效价动态变化
  • 4 讨论
  • 4.1 重组GoIL-2蛋白的乳化对其佐剂效果的影响
  • 4.2 重组GoIL-2蛋白免疫时间对其佐剂效果的影响
  • 4.3 重组GoIL-2蛋白对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫青年鹅的外周血T淋巴细胞转化效果的影响
  • 4.4 小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫青年鹅的血清抗体IgG的影响
  • 4.5 重组GoIL-2蛋白对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫青年鹅的中和效价的影响
  • 4.6 重组GoIL-2蛋白不同免疫剂量对其佐剂效应的影响
  • 第四章 重组GOIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫开产前种鹅佐剂效应研究
  • 1 材料
  • 1.1 疫苗、毒株、细胞
  • 1.2 试验动物
  • 1.3 主要试剂及配制
  • 1.4 主要仪器设备
  • 2 方法
  • 2.1 重组鹅IL-2蛋白佐剂的制备
  • 2.2 动物试验分组、免疫及样品采集
  • 2.3 卵黄收集及处理方法
  • 2.4 血清和卵黄样品ELISA抗体的检测
  • 2.5 血清和卵黄样品微量病毒中和试验
  • 2.6 免疫种鹅后代雏鹅攻毒保护试验
  • 2.7 攻毒保护率的计算方法
  • 3 结果
  • 3.1 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫种鹅卵黄ELISA抗体的动态变化
  • 3.2 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫种鹅血清ELISA抗体的动态变化
  • 3.3 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫种鹅卵黄中和抗体的动态变化
  • 3.4 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫种鹅血清中和抗体的动态变化
  • 3.5 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫种鹅卵黄ELISA抗体的动态变化
  • 3.6 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫种鹅血清ELISA抗体的动态变化
  • 3.7 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫种鹅卵黄中和抗体的动态变化
  • 3.8 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫种鹅血清中和抗体的动态变化
  • 3.9 重组GoIL-2对GPV弱毒疫苗免疫种鹅卵黄ELISA抗体的动态变化
  • 3.10 重组GoIL-2对GPV弱毒疫苗免疫种鹅血清ELISA抗体的动态变化
  • 3.11 重组GoIL-2对GPV弱毒疫苗免疫种鹅卵黄中和抗体的动态变化
  • 3.12 重组GoIL-2对GPV弱毒疫苗免疫种鹅血清中和抗体的动态变化
  • 3.13 后代雏鹅攻毒保护试验结果
  • 3.13.1 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v免疫种鹅后仔代对小鹅瘟强毒攻击的保护结果
  • 3.13.2 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag10v免疫种鹅后仔代对小鹅瘟强毒攻击的保护结果
  • 3.13.3 重组GoIL-2对GPV弱毒疫苗免疫种鹅后仔代对小鹅瘟强毒攻击的保护结果
  • 4 讨论
  • 4.1 种鹅血清抗体与卵黄抗体及其后代雏鹅免疫保护率的关系
  • 4.2 重组GoIL-2对小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫种鹅后种鹅卵黄抗体动态变化的影响及其子一代保护率的关系
  • 4.3 重组鹅IL-2蛋白研究意义及展望
  • 第三部分 结论
  • 第四部分 参考文献
  • 附录一
  • 附录二
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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