论文摘要
研究背景自从间充质干细胞于1966年被Friedenstein从骨髓中发现开始,越来越多的研究发现间充质干细胞在一定的条件下具有向内、中、外三个胚层分化的能力,其中包括分化为骨细胞软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、肝细胞、心肌细胞等多种细胞的潜能,可以广泛参与组织器官损伤的修复过程,成为组织工程和干细胞治疗领域的研究热点。其中骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）凭借易于培养扩增、遗传背景相对稳定且多向分化特性不受影响等特性,被广泛用于细胞及组织多种疾病的替代治疗。但随着对间充质干细胞研究的不断深入,发现成年动物骨髓源间充质干细胞数量及增殖、分化潜能随年龄的增大而不断下降,且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术,由于疾病的原因,病人常有感染、体质较弱等因素也限制了自体骨髓间充质干细胞移植的广泛应用。因此寻找新的间充质干细胞来源是近年来国内外干细胞研究的热点之一。1991年,McElreavey等首次报道,从人脐带的WJ组织中分离并培养到了一种成纤维样细胞,具有较高的分化潜能。随后,数位研究者也分别报道从WJ中分离到丰富的MSCs。通过大量体外诱导实验证实,特定条件下其同样具有成骨、成软骨、成脂肪、成肌肉、成血管内皮、成神经细胞等多向分化能力,通过和其他来源MSCs特别是和作为MSCs金标准的BMSCs相比,脐带间充质干细胞具有巨大优势：首先,来源广泛,取材方便,供者无痛苦；其次,相对纯净,污染机会少；第三,含量丰富,较为原始,增殖分化能力强,免疫原性低,生物性能稳定,可以为实验和临床提供充足的细胞来源。因此,脐带间充质干细胞有望成为骨髓间充质干细胞的理想替代来源,成为近来基础研究与临床广泛研究的热点。科研人员和公众均寄希望通过间充质干细胞领域的研究治愈诸如难愈性创面,多脏器损伤,心肌梗死等传统方式治疗效果欠佳的疾病。尽管目前间充质干细胞治疗在临床上的效果尚未得到完全确证,还是有越来越多的国家正加入此项研究。然而,间充质干细胞治疗要想真正从实验室走向临床应用还面临着诸多挑战,尚有很多关键性问题亟待解决。特别是间充质干细胞体外的生物学特性研究至关重要,是其临床应用的基础及前提。蜕皮甾酮（EDS）,是一种调控昆虫蜕皮过程的激素,广泛存在于众多植物类群及动物类群中,结构类似于雌二醇,实验证实其能够有效促进哺乳动物的多种组织和器官的核酸与蛋白质的合成及糖和脂类代谢。由于该类物质来源广泛,生物学特性复杂,因此吸引了许多学者投身其研究工作。Otaka等报道羟基蜕皮甾酮无论体内还是体外实验均可迅速刺激大鼠肝脏蛋白的合成。体外实验中,羟基蜕皮甾酮能够通过促进合成,进而增强微粒体和核糖体的蛋白合成能力。Yoshida T等报道了蜕皮甾酮对糖代谢的调节效应,预先腹腔注射羟基蜕皮甾酮能够对抗腹腔注射胰高血糖素及静脉注射抗胰岛素引起的高血糖症。Syrov VN等报道蜕皮甾醇具有保护肝脏的作用。随着研究的不断深入,蜕皮甾酮更多的生物学特性将被揭示出来。本课题组前期研究发现EDS具有促进人脐静脉内皮细胞增殖,促进创伤皮肤愈合,促进表皮及骨髓间充质干细胞增殖等作用。最新研究表明,特定条件下甾体类激素地塞米松具有诱导hUCMSCs分化为骨细胞并表达骨桥蛋白、涎蛋白、骨连接素等骨性标志物的能力,且可在黏多糖的基质上形成类似于关节软骨的球状骨针,可有效诱导间充质干细胞的成骨分化,同属甾体类物质的蜕皮甾酮表现出的生物多效性,提示其对促脐带间充质干细胞增殖及诱导分化等方面有一定的影响,最新研究显示间充质干细胞经诱导剂作用后可有效治疗骨质疏松等疾病,EDS能否诱导脐带间充质干细胞成骨分化尚不明确,进行此项研究具有广阔的应用前景。第一部分人脐带间充质干细胞的体外分离培养、冻存复苏及鉴定实验一人脐带间充质干细胞体外分离、培养及鉴定目的分离培养并鉴定人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）,为后续实验提供充足的种子细胞。方法采用酶消化法及组织块培养法分离出hUCMSCs,通过培养、传代扩增,从而获取相对均一、足够数量的脐带间充质干细胞。取第3代hUCMSCs通过细胞流式学检测对脐带间充质干细胞表面特异性标志CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105及多向分化能力加以鉴定。取第3、7代hUCMSCs绘制细胞生长曲线,并观察细胞形态学变化。结果1、hUCMSCs的形态学观察：倒置显微镜下观察,酶消化法所得细胞,原代接种24 h可见有少量细胞贴壁,外观呈纺锤形和短棒形,并可见细胞核。培养至5d左右细胞大部为双突起的长梭形、扁平形生长,核仁较前明显。培养至10d左右,细胞形态变为为典型的成纤维细胞形态,当细胞达到80%融合时予以消化、传代。传代培养至P3后可出现明显的单一细胞集落。从原代培养来看,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10d就可以进行传代,而组织块培养法要14d才能传代,形态学变化及之后的传代两者之间没有显著性差别。2、流式细胞学检测：CD34阳性率为7.54%,CD45阳性率为5.35%,CD29阳性率为98.45%,CD44阳性率为97.83%,CD90阳性率为97.36%,CD105阳性率为99.20%.3、hUCMSCs体外多向诱导分化：3.1 hUCMSCs成骨诱导的形态变化及功能鉴定：成骨诱导5d左右,细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或多角形等。高倍显微镜下观察可见细胞质内含颗粒样物质。诱导10d,细胞胞质中及胞质外均可见较多细小黑色颗粒,胞核颜色较淡,胞质色变深。3W时细胞生长密集,中央可见类似结节状的结构,部分细胞呈现层叠样生长。碱性磷酸酶及茜素红染色显示强阳性,符合成骨细胞的特征。说明hUCMSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜能。3.2 hUCMSCs成脂诱导的形态变化及功能鉴定：成脂诱导7d左右,细胞形态逐渐由长梭形变为短柱形；在诱导约14d时细胞变为椭圆形、圆形；20d时胞质内可见脂滴形成,油红“O”染色呈强阳性。表明hUCMSCs在体外具有向脂肪细胞分化的潜能。4、hUCMSCs生长曲线：hUCMSCs生长曲线呈“S”形,接种后第1-2天为潜伏适应期,从第3天起细胞开始增殖并进入对数生长期,第5天达到高峰,7天以后进入平台期。根据生长曲线可知hUCMSCs的群体倍增时间约为24h。增殖曲线显示本实验中P3、P7代细胞增殖速率无显著差异。结论1、hUCMSCs可通过酶消化法及组织块培养法体外分离、纯化培养,细胞生长稳定,可连续传代。组织块培养法的原代培养时间为14-16 d,培养时间较长,而采用胶原酶消化法可快速获得大量贴壁生长的MSCs,且操作简便易行,可更好地保持细胞活力,大大缩短了原代培养时间。2、经流式细胞仪检测,hUCMSCs均一地高表达间质细胞标志CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血系标志CD34、CD45,本实验结果表明,hUCMSCs与其他组织来源的MSCs流式检测表型一致。3、经成骨和成脂诱导培养基诱导后,通过ALP染色以及茜素红染色证实分化为成骨细胞,通过油红“O”染色证实分化为脂肪细胞,实验证实分离所得hUCMSCs具有多向分化能力。4、hUCMSCs随着传代次数增加增殖能力未见显著降低。实验二人脐带间充质干细胞冻存复苏后的生物学特性研究目的观察冻存复苏后人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）的复苏率及增值活性,探讨液氮长期保存间充质细胞的可行性。方法参照前面方法体外分离培养获得原代人脐带间充质干细胞,采用改良分阶段冻存方法,5个月后复苏细胞培养,观察比较各实验组细胞成活率和MTT法检测细胞增值能力的差异,流式细胞仪检测冻存细胞的表型变化。结果1.复苏hUCMSCs的形态学特征。复苏后细胞2h即开始贴壁,逐渐转变为梭形及多角形。复苏细胞一周左右即可传代,传至第3代时,细胞形态与正常培养对照组无明显差别。2流式细胞检测复苏hUCMSCs符合间充质干细胞的表型特征。MTT法检测显示低温冻存并没有降低间充质干细胞增殖活性。结论通过检测冻存复苏细胞的存活率,脐带间充质干细胞表面标志未发生改变,表明液氮冻存法可长期保存间充质干细胞；另外,恰当选择对数生长期的细胞冻存,且冻存细胞浓度应达到1×106/ml,对于保证冻存成功同样起着关键作用。第二部分：蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞体外增殖的实验研究目的观察蜕皮甾酮（Ecdysterone,EDS）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）体外增殖的影响,并探讨其促进细胞增殖的可能机制。方法取第3代hUCMSCs分别在基础培养基（低糖DMEM培养基、10%的胎牛血清、100U/m青/霉素、4mmol/L L-谷氨酰胺）中加入不同浓度（0、25、50、100、150、200μg/ml） EDS予以干预,分别于第1、3、5、7天行MTT法检测细胞增殖活性；另外,设置相同分组EDS干预培养hUCMSCs7天,绘制细胞生长曲线,观察比较细胞增殖差异。经细胞流式仪测定不同分组细胞周期,观察增殖期细胞所占比例。对数据行统计学处理。结果1、MTT法检测结果显示经EDS干预培养的hUCMSCs增殖能力较空白对照组有显著差异（P<0.05）,其中EDS 100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三组细胞活性比较无显著差异（P>0.05）,较其他实验组有统计学意义（P<0.05）。2、细胞生长曲线同样显示EDS实验组可有效促进间充质干细胞的增殖。其中EDS 100μg/ml实验组促增殖效果最明显, EDS 100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三组未见显著性差异。3、流式细胞仪测定各组细胞周期显示：EDS 100μg/ml、50μg/ml及200μg/ml三组细胞S期细胞所占比例最大,与其他实验组比较有显著差异,同时三组细胞的增殖指数也显著高于对照组。结论本实验证实体外条件下,EDS在一定浓度范围内具有促进hUCMSCs增殖的作用,该作用具有一定的浓度依赖性,当EDS浓度为100μg/ml促增殖作用达到最佳效果,初步机制认为EDS主要是通过改变细胞周期促进细胞增殖。第三部分：蜕皮甾酮诱导人脐带间充质干细胞成骨分化的初步研究目的观察蜕皮甾酮（Ecdysterone,EDS）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）成骨分化的影响。方法人脐带间充质干细胞的分离、培养鉴定,取第5代脐带间充质干细胞分别在基础诱导培养基中加入不同浓度EDS和地塞米松予以干预,分别于第1、3、5、7天MTT法检测细胞增殖率；另外,设置相同的分组诱导培养4周后,行茜素红及碱性磷酸酶钙钴法染色鉴定细胞成骨分化能力,计算阳性细胞百分比。结果1.MTT检测显示一定范围内EDS在基础诱导培养基中具有促进细胞增殖的作用,浓度增高至200μg/ml对细胞表现抑制作用,地塞米松对细胞增殖有抑制作用。2、茜素红及碱性磷酸酶钙钴法染色鉴定显示基础诱导培养组细胞染色阴性,EDS及地塞米松组实验组均可以诱导hUCMSCs钙化结节形成,比较发现EDS200μg/ml组细胞阳性率与经典诱导组无显著差异（P>0.05）, EDS200μg/ml组与经典诱导组成骨细胞阳性率均显著高于EDS100μg/ml组（P<0.01）。结论EDS在浓度200μg/ml时具有诱导hUCMSCs成骨分化的作用,但对细胞增殖抑制作用显著。初步认为EDS通过雌激素受体发挥此作用。EDS200μg/ml组较EDS100μg/ml组成骨作用差异显著,表明诱导成骨作用具有一定的浓度依赖性。