论文题目: 鱼类淋巴囊肿病毒核酸检测诊断技术的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 水产养殖
作者: 王越
导师: 战文斌
关键词: 淋巴囊肿病毒,检测诊断技术,流行情况
文献来源: 中国海洋大学
发表年度: 2005
论文摘要: 由淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)引起的淋巴囊肿病主要表现为一种慢性皮肤瘤,通常发生于鱼的体表皮肤、鳍等处。目前,该病在世界范围内己感染了包括海水、淡水和半咸水的42科125种以上的鱼类。自从1992年,我国在养殖的石斑鱼、红鱼中发现淋巴囊肿病以来,受感染的鱼类已有真鲷(Pagrosomus major)、鲈(Lateolabrax japonica)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等10余种。淋巴囊肿病是一种慢性疾病,潜伏期长达几个星期,发病后的鱼体外观丑陋,使之丧失商品价值,从而造成严重的经济损失,制约了海水鱼类养殖业的发展。因此,建立淋巴囊肿病的早期检测和诊断技术对控制该病的发生和蔓延显得尤为重要。 在国家自然科学基金项目的资助下,本文建立了淋巴囊肿病毒的核酸检测诊断技术,并开展了该病流行情况的调查。 取青岛市黄岛某养殖场具典型症状的牙鲆体表囊肿,经匀浆机匀浆、冻融三次、手动匀浆、超声波破碎后,通过差速离心和蔗糖密度梯度离心,在37%～40%和47%～50%的蔗糖界面上有折光带形成。经负染,透射电镜观察后发现37%～40%带中病毒粒子较少,杂质较多;47%～50%带中病毒粒子密度大,基本没有杂质,且病毒完整,直径约为230nm。 病毒粒子经蛋白酶K和SDS消化后,用苯酚/氯仿抽提法提取病毒核酸,产量约为2.30μg/μl。病毒基因组DNA用BanⅡ、BgⅢ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后,形成的片段数目分别为4、11、10、10、6、17和4。以λDNA/HindⅢ酶切片段和DNA Marker DL2,000作为标准,用Bio-Rad Quantity One软件计算出各酶切片段的分子量,由各酶切片段总和计算出LCDV青岛分离株的基因组DNA大小平均值约为56.0 kb,即Mr约为37.0×10~6 D。病毒DNA经Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ酶切进行的甲基化分析表明,病毒基因组DNA能被对CpG甲基化修饰不敏感的Msp Ⅰ切开,而不能被CpG甲基化修饰敏感的HpaⅡ切开,由此证明LCDV DNA胞嘧啶5’端高度甲基化。 根据LCDV的主要核衣壳蛋白基因序列(GenBank:AF126405),设计了一步PCR和巢式PCR引物。在根据Primer premier 5.0分析获得的引物退火温度基础
论文目录:
0 前言
1 淋巴囊肿病毒的纯化
1．1 材料和方法
1．1．1 实验材料
1．1．2 实验方法
1．1．2．1 病毒的提纯
1．1．2．2 病毒的负染观察
1．2 结果
1．3 讨论
2 淋巴囊肿病毒核酸的提取和酶切图谱分析
2．1 材料和方法
2．1．1 实验材料
2．1．2 实验方法
2．1．2．1 病毒核酸的提取
2．1．2．2 核酸浓度的测定
2．1．2．3 病毒DNA的限制性内切酶图谱分析
2．2 结果
2．3 讨论
3 淋巴囊肿病毒的PCR检测技术
3．1 材料和方法
3．1．1 实验材料
3．1．2 实验方法
3．1．2．1 健康牙鲆组织DNA的提取
3．1．2．2 PCR引物的设计
3．1．2．3 以P1/P2为引物的一步PCR反应及退火温度的优化
3．1．2．4 巢式PCR反应及退火温度的优化
3．1．2．5 特异性实验
3．1．2．6 灵敏度实验
3．2 结果
3．3 讨论
4 淋巴囊肿病毒的斑点杂交(Dot-Blot)检测技术和Southern杂交分析
4．1 材料和方法
4．1．1 实验材料
4．1．2 实验方法
4．1．2．1 引物
4．1．2．2 PCR法快速制备DIG标记探针
4．1．2．3 DIG标记探针的纯化
4．1．2．4 用LCDV DIG标记探针斑点杂交法(Dot-Blot)的建立
4．1．2．5 用LCDV DIG标记探针的灵敏度实验
4．1．2．6 淋巴囊肿病毒的Southern杂交分析
4．1．2．7 对几种已知淋巴囊肿病毒主要核衣壳蛋白(Major capsid protein，mcp)基因序列酶切位点的分析
4．2 结果
4．3 讨论
5 淋巴囊肿病毒的原位杂交检测技术
5．1 材料和方法
5．1．1 实验材料
5．1．2 实验方法
5．1．2．1 载玻片和盖玻片的准备
5．1．2．2 淋巴囊肿病毒的核酸探针原位杂交检测技术
5．1．2．3 组织切片的苏木精—曙红染色
5．2 结果
5．3 讨论
6 淋巴囊肿病流行情况的调查
6．1 材料和方法
6．1．1 实验材料
6．1．2 实验方法
6．1．2．1 甲醛固定组织DNA的提取
6．1．2．2 运用PCR和原位杂交技术检测不同感染状态的患病牙鲆
6．1．2．3 运用PCR技术检测不同地区患病牙鲆
6．1．2．4 运用PCR技术检测不同患病鱼鲆
6．2 结果
6．3 讨论
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2005-10-26
参考文献
- [1].牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的研制及应用[D]. 程顺峰.中国海洋大学2006
- [2].淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus）核酸疫苗的免疫效果评价及安全性研究[D]. 郑风荣.中国海洋大学2006
- [3].淋巴囊肿病毒口服微囊核酸疫苗的研制与免疫效果研究[D]. 田继远.中国海洋大学2008
- [4].淋巴囊肿病毒中国分离株（LCDV-cn）系统关系分析与功能基因研究[D]. 闫秀英.中国海洋大学2008
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- [6].牙鲆淋巴囊肿病毒黏附蛋白及受体蛋白的研究[D]. 刁菁.中国海洋大学2008
- [7].牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析[D]. 汪沐.中国海洋大学2012
- [8].鱼类淋巴囊肿病毒感染对27.8kDa受体表达及牙鲆鳃转录组表达的影响[D]. 吴荣华.中国海洋大学2015
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