大连海域可培养海洋放线菌的分离筛选及鉴定

论文摘要

海泥中孕育着丰富的微生物资源,包括能产生各种次级代谢产物的海洋放线菌。本文采用9种分离培养基对大连海域13个不同采样地点的海泥样品进行放线菌分离,通过湿热处理及不处理2种方法,以制霉菌素和重铬酸钾为抑制剂,共分离到165株海洋放线菌。结果表明,在9种分离培养基中,LSE-SE-2为最有效的分离培养基,其次分别为燕麦培养基、M2培养基及HV-2培养基,而M13是分离到放线菌数目最少的培养基。两种处理方法分离到的放线菌数目基本相同,湿热处理后的海泥分离到85株海洋放线菌,未经任何处理的海泥分离到80株海洋放线菌。对分离到的165株放线菌进行抗菌活性测定,结果表明有89株放线菌具有拮抗活性,占总分菌数的54%,其中对大肠杆菌具有活性的菌株26株,占总菌株数的16.4%,对金黄色葡萄球菌具有活性的菌株85株,占总菌株数的51.5%,对尖孢镰刀菌具有活性的菌株仅有6株,占总菌株数的3.6%。对具有抗菌活性或形态独特的95株放线菌进行16S rDNA序列分析,结果表明,95株海洋放线菌可分为两大类,即链霉菌属和拟诺卡氏菌属。通过构建95株海洋放线菌的16S rDNA系统发育树,表明从大连海域海泥中分离到的海洋放线菌具有多样性,共分为37类链霉菌和4类拟诺卡氏菌;而通过构建对大肠杆菌具有拮抗活性的菌株的16S rDNA系统发育树,表明这些菌株分属于13类链霉菌和3类拟诺卡氏菌;同样的,通过系统发育分析,可以将对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性的菌株分为29类链霉菌和4类拟诺卡氏菌。全部测序菌株与NCBI数据库进行比较,16株海洋放线菌的16S rDNA序列相似度低于99%,结合16株放线菌的形态特征、培养特征、生理生化特征,确定这16株放线菌分别为Streptomyces matensis（HA5）、Streptomyces albogriseolus（HC7）、Streptomyces globisporus（M8）、Streptomyces hawaiiensis（M76）、Streptomyces macrosporus（M77）、Nocardiopsis dassonvillei（MH28,PH26）、Streptomyces parvus（PH33）、Nocardiopsis terrae（HV3）、Streptomyces fimicarius（HW27）、Streptomyces pluricolorescens（HW66）、Streptomyces fradiae（HL9）、Nocardiopsis aegyptia（HE9）、Streptomyces rubiginosohelvolu（sHE16）、Streptomycescoelicoflavus（HE18）、Streptomyces cinereorectus（HE55）。其中菌株MH28和PH26最终鉴定为同一菌株,都是Nocardiopsis dassonvillei。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 海洋放线菌研究概述
• 1.1.1 海洋放线菌的分布
• 1.1.2 海洋放线菌的生物活性物质
• 1.2 海洋放线菌的筛选方法
• 1.2.1 培养基的选择
• 1.2.2 预处理技术
• 1.2.3 抑制剂的选择
• 1.2.4 噬菌体用于分离稀有放线菌
• 1.3 放线菌的多相分类方法
• 1.3.1 表型信息
• 1.3.2 基因型信息
• 1.3.3 系统发育信息
• 1.4 论文设计思路
• 1.5 本研究的主要技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验样品
• 2.1.2 抗菌活性筛选待测菌株
• 2.1.3 抗菌活性筛选指示菌
• 2.1.4 主要药品
• 2.1.5 海洋放线菌分离培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 主要试剂及缓冲液的配制
• 2.1.8 待鉴定菌株
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 样品预处理
• 2.2.2 海泥样品中放线菌的分离培养
• 2.2.3 可培养放线菌的抗菌活性筛选
• 2.2.4 放线菌基因组DNA 提取
• 2.2.5 放线菌16S rDNA 的PCR 扩增
• 2.2.6 放线菌的16S rDNA 测序分析
• 2.2.7 代表菌株形态特征和培养特征观察
• 2.2.8 代表菌株的生理生化特征
• 2.2.9 海洋放线菌多样性分析
• 2.2.10 海洋拮抗放线菌多样性分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 可培养放线菌的分离
• 3.1.1 不同海泥样品中海洋放线菌的分离
• 3.1.2 预处理方法对海泥样品中海洋放线菌分离的影响
• 3.1.3 不同培养基中海洋放线菌的分离
• 3.2 可培养放线菌的抗菌活性检测
• 3.2.1 抗大肠杆菌活性检测
• 3.2.2 抗金黄色葡萄球菌活性检测
• 3.2.3 抗尖孢镰刀菌活性检测
• 3.3 放线菌DNA 提取及16S rDNA 的PCR 扩增
• 3.3.1 放线菌基因组DNA 提取
• 3.3.2 16S rDNA 的PCR 扩增
• 3.4 16S rDNA 序列分析
• 3.5 代表菌株的形态特征
• 3.6 代表菌株的生理生化特点
• 3.6.1 菌株的耐盐性
• 3.6.2 菌株生长的温度
• 3.6.3 菌株生长的pH
• 3.6.4 菌株的生理生化鉴定
• 3.6.5 菌株的碳源利用情况
• 3.7 海洋放线菌多样性分析
• 3.8 海洋拮抗放线菌多样性分析
• 第4章 讨论
• 4.1 海洋放线菌的分离和筛选研究
• 4.1.1 不同采样地点对放线菌分离的影响
• 4.1.2 分离方法对放线菌分离的影响
• 4.2 可培养海洋放线菌对不同测试菌的抑菌活性研究
• 4.3 代表菌株的系统发育分析
• 4.4 海洋放线菌多样性研究
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文