罗氏沼虾雄性生殖系统特异性分子机制

论文摘要

生物的性别、生殖现象是生物学研究的主要内容之一,它涉及到许多重大的生物学问题,比如性别决定、遗传、发育和进化等,因此历来倍受关注。 目前对于性别、生殖的分子机制研究主要集中在人类和模式生物中,而对于一般水生生物这方面的研究很少,尤其在甲壳类中,已知的相关分子信息更加缺乏。虾类作为具有重要经济价值的水生生物,在分子水平的研究开展得相对较少,因此,大量获取水生动物性别和生殖相关基因资源来研究它们的生殖生物学、遗传育种等显得尤为必要。 本论文以罗氏沼虾为研究对象,开展关于性别与生殖相关分子机制的研究。在甲壳动物中首次采用大规模筛选差异基因的方法,即抑制性消减杂交,利用该方法建立了富含雄性特异性基因的消减文库。通过筛选差异性文库并测序,在Genbank通过BLAST比对,发现一个克隆包含两个保守的Kazal型domain,命名为MRPINK,另外三个序列是新的表达序列,其中之一包含有开放阅读框（ORF）,命名为Mar-Mrr。 在此基础上应用5’-RACE和3’-RACE的方法,直接体外扩增,从而获得基因全长cDNA。Mar-Mrr cDNA全长为683bp,编码区333bp,编码110个氨基酸,分子量约11.7kDa。Mar-Mrr基因5’和3’非翻译区长度分别是82bp和268bp,其中3’非翻译区具有两个多聚腺苷酸信号,分别位于poly（A）上游64bp和14bp;推演的多肽含有24个氨基酸的信号肽和86个氨基酸的成熟肽,其中Gly、Ser和Ala含量较高,分别为15.4%、10.9%和9.1%。MRPINK cDNA全长为736bp,编码区405bp,编码135个氨基酸,分子量约14.7kDa的多肽分子,MRPINK基因5’和3’非翻译区长度分别是72bp和247bp,其中3’非翻译区具有一个多聚腺苷酸信号;推演的氨基酸序列中含有两个Kazal型domain,且包含21个氨基酸的信号肽。 Mar-Mrr与Genbank已知序列无同源性、相似性,在罗氏沼虾中属于首次克隆到的雄性生殖相关功能基因。MRPINK和已知的Kazal型蛋白酶抑制剂在氨基酸序列上的同源性为16-32%,其Kazal型domain序列上有19-52%的同源性,表明这个蛋白属于Kazal家族中的成员,在无脊椎动物中,这是首次获得与性别生殖相关的Kazal型蛋白酶抑制剂的基因信息。此外含有两个Kazal型结构域并

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 1. 哺乳动物性别生殖相关研究进展
• 1.1 哺乳动物性别决定相关分子及其作用机制
• 1.2 哺乳动物性别决定模型
• 2. 抑制性消减杂交方法研究进展
• 2.1 抑制性消减杂交原理
• 2.2 抑制性消减杂交方法的改进与近期相关方法简介
• 参考文献
• 第一章 罗氏沼虾雄性生殖系统消减文库的构建
• 1. 引言
• 2. 材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3. 方法
• 3.1 罗氏沼虾生殖系统总 RNA的抽提
• +RNA的提取'>3.2 罗氏沼虾生殖系统 PolyA⁺RNA的提取
• 3.3 罗氏沼虾雄性生殖系统SSH cDNA文库的建立
• 3.4 建立 SSH cDNA文库的鉴定
• 4. 结果
• 4.1 Rsa I酶切效果的判定
• 4.2 接头连接效率的检测
• 4.3 消减 PCR产物分析
• 4.4 消减效率的 PCR鉴定
• 4.5 消减cDNA文库 PCR插入片段的判定
• 4.6 分化筛选点杂交结果
• 4.7 挑取克隆测序和比对分析结果
• 5. 讨论
• 参考文献
• 第二章 罗氏沼虾雄性生殖系统两种基因的克隆
• 1. 引言
• 2. 材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3. 方法
• 3.1 罗氏沼虾取材
• 3.2 罗氏沼虾雄性生殖系统总 RNA的抽提
• 3.3 罗氏沼虾雄性生殖系统cDNA的合成
• 3.4 两种雄性生殖系统基因的克隆
• 4. 结果
• 4.1 Mar-Mrr全长cDNA的确定
• 4.2 MRPINK全长cDNA的确定
• 4.3 MRPINK与不同物种同源氨基酸序列的比较
• 5. 讨论
• 参考文献
• 第三章 罗氏沼虾雄性生殖系统两种基因表达特征研究
• 1. 引言
• 2. 材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3. 方法
• 3.1 罗氏沼虾取材
• 3.2 RNA抽提
• 3.3 Northern blotting
• 3.4 RT-PCR（Reverse transeription Polymerase chain reaction）
• 3.5 半定量 RT-PCR（semi-quantitative RT-PCR）
• 4. 结果
• 4.1 两种雄性生殖系统基因的组织表达特异性
• 4.2 MRPINK在雄性生殖系统中的表达
• 4.3 Mar-Mrr和 MRPINK基因在不同发育生长时期的表达
• 5. 讨论
• 参考文献
• 第四章 罗氏沼虾雄性生殖系统两种基因的组织定位和基因组结构研究
• 1. 引言
• 2. 材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3. 方法
• 3.1 罗氏沼虾的取材
• 3.2 原位杂交（In Situ Hybridization,ISH）
• 3.3 Mar-Mrr和MRPINK基因结构的分析
• 4. 结果
• 4.1 mRNA原位杂交检测结果
• 4.2 基因组检测结果
• 5. 讨论
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 1. 结论
• 2. 有待近一步开展的工作
• 本研究的创新点
• 附录一 常用试剂配制一览表
• 附录二 攻读博士学位期间发表、投稿论文
• 致谢