论文摘要
前言肺纤维化是以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质成分如胶原蛋白大量沉积而导致正常的肺组织结构改变和功能丧失的一类疾病。肺纤维化疾病包括特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）、尘肺、药物和放射线导致的纤维化等。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）在肺纤维化的发生发展中起关键的作用。肺损伤后肺巨噬细胞受到刺激而被激活,分泌大量潜在非活化形式的TGF-β1,称之为潜在TGF-β1（latent-TGF-β1,L-TGF-β1）,这种L-TGF-β1是由潜在联系多肽（Latency-associated peptide,LAP）和TGF-β1以1:1的比率非共价结合而成的蛋白复合物,该蛋白复合物不能与TGF-β1受体结合,因此不能发挥其生物学活性。血小板反应素-1（trombospondin-1,TSP-1）是L-TGF-β1活化过程中一个重要介质。TSP-1由3条相同肽链构成的同源三聚体基质糖蛋白,每条肽链由N端、C端球状结构域、原胶原同源区、type1重复序列、type2重复序列、type3重复序列组成。其中type1重复序列（thrombospondin type1 repeats,TSRs）由3个备解素样基序（TSR1、TSR2、TSR3）组成。目前已清楚,TSP-1分子KRFK序列可与L-TGF-β1分子的LAP相互作用,形成TSF-1/L-TGF-β1蛋白复合物。TSR2和TSR3基序中的CSVTCG氨基酸结构域与肺巨噬细胞膜上TSP-1受体CD36特异结合,再形成CD36/TSP-1/L-TGF-β1蛋白复合物,被激活的肺巨噬细胞同时还合成大量的纤溶酶,该蛋白复合物在纤溶酶的作用下发生空间构象变化,使TGF-β1与LAP发生分离,从而产生活化的TGF-β1,继而发挥致纤维化作用。依据L-TGF-β1活化机制,TSP-1/L-TGF-β1蛋白复合物通过TSP-1与肺巨噬细胞膜上TSP-1受体CD36特异结合,这个过程是L-TGF-β1活化的关键环节。TSP-1主要依靠TSR2-3基序中以CSVTCG氨基酸肽段为主的结构域与CD36特异结合。据此,该研究应用含有CSVTCG氨基酸序列的TSP-1功能片段,利用其可以与肺巨噬细胞膜上CD36特异结合的特性,从源头上阻抑活化的TGF-β1的产生,从而更有效地抑制肺纤维化的发生发展。本实验对含有CSVTCG氨基酸结构域TSP-1分子中TSR2-3进行基因克隆、扩增及目的蛋白的表达,并在体外、体内进一步观察TSP-1功能片段阻抑L-TGF-β1活化及其在肺纤维化动物模型体内抑制肺纤维化发生发展的效果,这将为阐明肺纤维化的分子机制提供实验依据。材料与方法一、pGEX-5X-2-TSR2-3重组质粒的构建与鉴定采用TRIZOL一步法提取小鼠肺组织中总mRNA,RT-PCR扩增TSR2-3基因片段。pGEX-5X-2载体和目的基因片段经EcolRⅠ、XolⅠ双酶切后连接构建pGEX-5X-2-TSR2-3重组质粒。重组质粒并转化入宿主菌DH5α,菌液涂布于琼脂培养基上培养。随机挑取单菌落,培养过夜,提取质粒DNA,双酶切鉴定阳性菌落。二、pGEX-5X-2-TSR2-3重组质粒在大肠杆菌中的蛋白表达、鉴定及纯化阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,应用浓度为1.0 mmol/L的IPTG 30℃条件下诱导培养3h。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）分析表达产物,考马斯亮蓝染色。免疫印迹鉴定（Western blot）鉴定表达产物,谷胱甘肽-S-转移酶（GST）抗体反应过夜,ECL化学发光系统显色。GSTrapFF柱亲和层析纯化目的重组蛋白。三、细胞免疫荧光方法检测TSR2-3 GST融合蛋白活性及TSP-1功能片段对L-TGF-β1活化的抑制作用大鼠肺内注入博来霉素第7天,行气管肺泡灌洗,收集灌洗液,获得肺巨噬细胞。①加入TSR2-3 GST融合蛋白及GST蛋白,GST、CD36一抗反应过夜,FITC、TRITC荧光标记的二抗定位,加核荧光染料TOP3染核。②加入TSR2-3 GST融合蛋白、GST蛋白、TSP-1功能肽段、对照肽段和CD36抗体,TGF-β1、CD36一抗反应过夜,FITC、TRITC荧光标记的二抗定位,加核荧光染料Hoechst染核。荧光显微镜下观察。四、酶联免疫吸附双抗体夹心法（ELISA）方法检测巨噬细胞培养上清液中TGF-β1含量未经过HCl酸化的为活化TGF-β1量,经过HCl酸化的为总TGF-β1量。捕获抗体包板,4℃培养过夜。加封闭液,室温培养1h。加标准品和样品,室温培养2h,加检测抗体室温培养2h。加辣根过氧化物酶封板,避光室温培养20min。加底物,避光室温培养20min。加终止液,用酶标仪在450nm处测量光密度值。五、肺组织羟脯氨酸含量测定碱水解方法测定肺组织羟脯氨酸含量,含量以μg/mg肺组织表示。六、肺组织学观察常规石蜡切片（5μm）,经脱蜡脱水后HE、vG染色,观察肺组织病理学改变。七、免疫组织化学方法观察肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达采用过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒（SP）对肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原进行染色。切片常规脱蜡至水,血清封闭,孵育30min;滴加稀释的Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体,4℃过夜;PBS洗涤,滴加二抗,孵育30min;PBS洗涤,滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液,孵育30min;PBS洗涤,滴加3,3-二氨基联苯胺（DAB）室温显色,苏木素复染,中性树脂封片。结果判断:免疫组化结果以细胞浆或细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性显色,并应用图像分析系统对蛋白表达进行定量分析。在10×40倍视野下,在每个切片随机选取5个视野。用阳性细胞平均积分光密度代表Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量。八、统计分析采用SPSS13.0统计学软件对数据进行方差分析,统计结果表示为（?）±s,差异有统计学意义时,用SNK法进行组间比较,P＜0.05具有统计学意义。实验结果一、重组pGEX-5X-2-TSR2-3质粒的筛选与鉴定RT-PCR扩增产物,琼脂糖凝胶电泳在约390bp处出现特异性DNA扩增条带,与预期理论推算一致。重组质粒pGEX-5X-2-TSR2-3经EcolRⅠ、XolⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳显示酶切片段大小与预期值相符,质粒pGEX-5X-2片段大小约为4.9kb,酶切片段大小约为360bp。测序结果与GenBank中TSP-1cDNA序列完全一致。二、重组TSR2-3 GST融合蛋白的表达与鉴定重组pGEX-5X-2-TSR2-3质粒在大肠杆菌BL21表达,表达产物在39kDa处呈现清晰的蛋白带,其分子量大小与预期结果一致。Western blot分析显示该条带在相应位置处可与抗GST抗体发生特异性结合反应。三、重组TSR2-3 GST融合蛋白纯化超声破菌后,经GSTrapFF亲和柱层析后,纯化产物在SDS-PAGE凝胶上显示目的蛋白单一蛋白条带。四、TSR2-3 GST融合蛋白活性检测结果加入TSR2-3 GST融合蛋白博莱霉素组大鼠巨噬细胞表面,可清晰看到大量绿色（CD36）和红色（GST）荧光颗粒重合形成黄色荧光颗粒,说明巨噬细胞表面CD36与TSR2-3 GST融合蛋白发生结合,具有功能活性。五、TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗体对巨噬细胞产生活化TGF-β1抑制作用的免疫荧光结果加入TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗体的巨噬细胞表面出现的绿色（CD36）荧光颗粒和红色（TGF-β1）荧光颗粒重合形成黄色荧光颗粒明显少于PBS、GST和TSP-1对照肽段组。说明TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗体抑制巨噬细胞产生活化的TGF-β1,使TGF-β1减少六、ELISA方法检测巨噬细胞培养上清液中TGF-β1含量的结果博莱霉素组和加入GST、TSP-1对照肽段组的大鼠巨噬细胞上清液中活化TGF-β1的含量及活化FGF-β1占总TGF-β1的百分比明显高于TSR2-3 GST融合蛋白、TSP-1功能肽段和CD36抗体组。七、小鼠肺羟脯氨酸测定结果灌注博莱霉素后7d时,博莱霉素组、给予功能肽段低、高剂量组和给予对照肽段低、高剂量组小鼠肺羟脯氨酸含量无统计学差异;在灌注后14、21d时,博莱霉素组、给予对照肽段低、高剂量组小鼠肺羟脯氨酸含量显著高于盐水对照组（P＜0.01或P＜0.05）,给予功能肽段低、高剂量组羟脯氨酸含量低于博莱霉素组（P＜0.01或P＜0.05）。八、肺病理学检查博莱霉素组和给予对照肽段低剂量、高剂量组小鼠在第7d时肺组织均呈现明显的肺泡炎改变。第14d肺泡炎减轻,肺泡间隔继续增宽,肺泡间隔中成纤维细胞增多。第21d肺泡炎减轻,细胞外基质增多,肺泡间隔明显增宽,肺泡腔变形,肺纤维化基本形成。给予功能肽段低剂量和高剂量组第7、14d肺泡炎均较博莱霉素组轻,第21d肺纤维化亦明显轻于博莱霉素组,各时间点胶原染色均明显轻于博莱霉素组。九、肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达各时间点对照组小鼠肺组织内有散在性分布的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白弱阳性反应。7d时博莱霉素组和给予对照肽段组小鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达较对照组有轻度增强,积分光密度值均高于对照组,但差异无统计学意义（P＞0.05）;给予功能肽段组小鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达与对照组小鼠相似,积分光密度值无统计学差异。14、21d时博莱霉素组、给予对照肽段组和功能肽段组小鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达较对照组均明显增强,3组积分光密度值均显著高于对照组（P＜0.01或P＜0.05）;给予功能肽段组在对应时点Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达明显轻于博莱霉素组,积分光密度值均显著低于博莱霉素组（P＜0.01或P＜0.05）。结论1、成功克隆小鼠TSR2-3基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度TSR2-3 GST融合蛋白。2、TSP-1功能片段可通过与巨噬细胞膜上的CD36特异结合阻抑内源性TSP-1/L-TGF-β1蛋白复合物与CD36结合进而抑制了L-TGF-β1的活化。3、CSVTCG/TSP-1功能肽段可降低由博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型的肺组织羟脯氨酸含量和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,减轻肺纤维化程度,具有抑制肺纤维化发生发展的作用。
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