用荧光共振能量转移技术构建的蛋白酶检测器

论文摘要

1 背景及目的 自1948年Forster等人提出荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）理论后,因其对距离的极度敏感性,FRET技术被广泛用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。而在维多利亚水母中发现的绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）及其变体的成功克隆和分离,为FRET技术提供了适宜的供受体对,大大促进了FRET技术的发展。近来,FRET以它稳定、无生物毒性、不需任何外源反应底物及表达无种属和组织特异性的优点,成为检测蛋白一受体、蛋白一蛋白之间相互作用和相对空间位置的“分子尺”。以FRET技术构建的生物传感器具有高灵敏度和高特异性,成为高通量筛选（High Throughput Screen, HTS）的最好系统之一。 前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA）是一种主要由前列腺上皮层分泌的丝氨酸蛋白酶,是目前临床上对前列腺癌进行早期诊断及监测的敏感的血清学指标。然而血清PSA水平并不具有疾病特异性,一些良性的前列腺疾病如前列腺增生等亦会引起血清总PSA含量的升高,尤其是血清中的总PSA含量在4～10ng/ml之间时,更难以做出鉴别诊断。因而其作为前列腺癌早期诊断指标的特异性还有待提高。研究表明,区分以及检测血清中不同形式存在的PSA浙江大学硕士学位论文齐小娟能够提高前列腺癌诊断的特异性。其中具有蛋白酶活性的PSA亦是可能的肿瘤标志物之一。但常规的免疫学方法无法予以有效鉴别。因此探索新的检测方法是非常必要的。 本研究的目的是:①构建可在体外应用荧光共振能量转移（FRET）技术检测具有酶活性的前列腺特异抗原（PSA）的生物检测器。②在此基础上,建立一套能普遍使用的蛋白酶活性检测的体外FRET系统,并选用半肤天冬蛋白酶一3（casPase一3）对其可行性进行验证和分析。2方法2.1本实验室的前期工作已成功构建原核细胞表达质粒PET-cFP一ssYYsG一YFP,从而可在大肠杆菌中诱导表达在供体增强型青色荧光蛋白（enhaneed eyan fluoreseent protein,ECFp）和受体增强型黄色荧光蛋白（enhaneed yellow nuoreseent protein,EYFp）之间以psA特异性识别氨基酸序列ssYYsG（ser一se卜val一val一ser一Gly）连接的融合蛋白。将纯化的融合蛋白依次用糜蛋白酶、胰蛋白酶、商品化的纯品PSA及精液切割,检测其荧光共振能量转移现象的变化。2.2在上述实验完成的基础上,我们用PCR技术从含有ecfP基因的质粒中扩增出在其两端加有限制性内切酶酶切位点的ecfP基因。然后把ecfn基因连入原核细胞表达质粒pET30a（+）一YFP中,获得一个原核细胞表达质粒pET30a（+）一CFP-多克隆位点（MCS）一YFP。在多克隆位点处可灵活插入多种蛋白酶的识别肤段的编码序列,通过观察其融合蛋白FRET现象的变化可对多种蛋白酶活性进行体外检测。为验证实验设计的可行性,在多克隆位点处插入caspase一3的特异性识别切割氨基酸序列DEVD（AsP一Glu一Va!一AsP）的编码序列,进而在大肠杆菌中诱导表达ECFP一DEVD一EYFP融合蛋白。在体外将纯化的融合蛋白与用凋亡诱导剂量DNA损伤剂MNNG处理后继续培养48h的FL细胞裂解液在室温下孵育,观察其荧光共振能量转移效应的变化。

论文目录

• 一、缩略语
• 二、论文摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 三、正文
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 四、综述
• 五、附录
• 六、致谢