长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA文库的构建及免疫学筛选

论文摘要

长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）及其传播的疾病严重威胁着我国畜牧业的发展。现在,对蜱的控制方法主要是化学药物应用,但随着蜱耐药性的产生以及环境污染和药物残留等严重公共卫生问题的出现迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制蜱的方法中,免疫学防制是前景最诱人的方法之一。本研究首先采用不同的免疫途径制备了两种兔抗长角血蜱阳性血清,旨在研究长角血蜱唾液腺的免疫特性。为了更好的研究长角血蜱的免疫原基因,本研究以半饱血长角血蜱雌蜱唾液腺为材料提取mRNA,反转录合成双链cDNA,并定向插入λ-SCREEN载体,成功地构建了长角血蜱的cDNA表达文库。为了获得抗原基因,本研究利用免疫印迹方法,用抗长角血蜱的血清筛选长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库,自动亚克隆为重组质粒p-SCREEN后转入JM109中,提取重组质粒进行PCR、酶切和测序分析。ELISA检测结果表明,叮咬组家兔血清中的抗体效价从初次叮咬后第三周开始呈阳性,随着叮咬次数的不断增加抗体水平也随之持续上升,在第11周时达到高峰;免疫组的家兔血清抗体水平持续上升,两组家兔均能表现出一定的抗蜱效应。实验证明,所构建的文库质量很高,基础库容量为4.2×106pfu,扩增后的文库滴度为7.8×109pfu/ml。经免疫学筛选得到26个的阳性克隆。经鉴定这些基因均来自长角血蜱,它们的大小在199bp1876bp之间。这为研制长角血蜱的分子疫苗和克隆功能基因奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 第一章 文献综述
• 1.1 目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 蜱的地理分布
• 1.2.2 蜱的功能分子的研究现状
• 1.2.2.1 微小牛蜱体内与免疫相关的重要功能分子
• 1.2.2.2 与长角血蜱有关的功能性抗原
• 1.2.2.3 其他重要功能分子
• 1.2.3 蜱功能分子的应用前景
• 1.2.3.1 抗蜱疫苗
• 1.2.3.2 抗病原传播疫苗
• 1.2.3.3 抗药性对策
• 1.2.3.4 新型生物制剂
• 1.2.4 蜱的免疫学防治进展
• 1.2.5 蜱诱导宿主免疫的研究进展
• 1.2.5.1 蜱叮咬免疫接种宿主后中肠病理变化的研究
• 1.2.5.2 蜱唾液腺抗原性的研究
• 1.2.5.3 宿主对蜱的免疫反应
• 1.2.5.4 蜱的免疫抑制
• 1.2.5.5 抗蜱免疫的机理
• 1.2.6 研制疫苗的科学依据
• 1.2.6.1 寄生虫生物学
• 1.2.6.2 分子生物学
• 1.2.6.3 免疫学
• 1.2.6.4 疫苗试验
• 1.2.7 已商业化的抗蜱疫苗
• 第二章 长角血蜱唾液腺蛋白和唾液蛋白免疫特性的研究及兔抗长角血蜱阳性血清的制备
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 利用不同免疫途径制备阳性血清
• 2.1.2.1.1 长角血蜱唾液腺蛋白抗原的制备
• 2.1.2.1.2 免疫血清的制备
• 2.1.2.1.3 长角血蜱在吸血过程中的体重等相关数据统计
• 2.1.2.1.4 ELISA 法检测家兔抗体效价
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 两种不同免疫途径所得阳性血清 ELISA 检测结果
• 2.2.2 不同抗体水平对蜱吸血和发育过程的影响
• 2.2.2.1 不同抗体水平对长角血蜱叮咬期、吸血期长短的影响
• 2.2.2.2 不同抗体水平对长角血蜱脱落率和死亡率的影响
• 2.2.2.3 不同抗体水平对长角血蜱饱血雌虫的体重的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 长角血蜱雌蜱唾液腺 CDNA 表达文库的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 长角血蜱的解剖
• 3.1.2.2 长角血蜱总 RNA 的提取
• 3.1.2.3 长角血蜱mRNA 的纯化
• 3.1.2.4 长角血蜱cDNA 表达文库的构建
• 3.1.2.4.1 cDNA 第一链的合成
• 3.1.2.4.2 cDNA 第二链的合成
• 3.1.2.4.3 末端修饰
• 3.1.2.4.4 柱层析选择大片段cDNA
• 3.1.2.4.5 cDNA与载体的连接
• 3.1.2.4.6 重组λ噬菌体的体外包装与铺板测定库容量
• 3.1.2.4.7 噬菌体文库的扩增
• 3.2 结果
• 3.2.1 RNA 和mRNA
• 3.2.2 双链cDNA 检测结果
• 3.2.3 大片段cDNA 的选择
• 3.2.4 cDNA 文库基础库容量
• 3.2.5 扩增文库库容量
• 3.3 讨论
• 第四章 长角血蜱雌蜱唾液腺 CDNA 表达文库的免疫学筛选和阳性克隆的鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 宿主菌的培养
• 4.1.2.2 噬菌体的准备
• 4.1.2.3 免疫学筛选
• 4.1.2.4 阳性对照
• 4.1.2.5 阳性克隆的鉴定
• 4.2 结果
• 4.2.1 阳性克隆的筛选结果
• 4.2.2 阳性克隆的鉴定
• 4.2.2.1 重组质粒的 PCR 与酶鉴定
• 4.2.2.2 阳性克隆的测序结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介