编码叶绿体/质体RNA结合蛋白及Na～+/K～+/Cl～-共转运体基因的功能研究

论文摘要

植物生长发育、分化、衰老和抗逆等生命过程是受严格的遗传调控的。这些过程实现的分子基础是基因的时空差异表达。在基因表达过程中,转录调控是基因表达调控的主要调控点。真核生物中,转录后调控更为复杂多样,转录后的调控能对基因表达最终产物的种类和数量（即蛋白质的复杂性）产生重要而直接的影响。基因在转录后,新合成的pre-mRNA或核不均一RNA（ hnRNA）要经过pre-mRNA剪接（pre-mRNA splicing）,5’端加帽（capping）,3’端合成多聚腺苷酸（polyA）尾（polyadenylation）等加工环节才能成为成熟的mRNA。许多环境及体内因子可通过调控基因表达和转录后过程影响植物的生长发育过程。RNA结合蛋白（RBPs）是一类参与转录后调控的重要蛋白。这类蛋白质可通过直接结合RNA或间接调节其它参与转录后调控的成分,影响pre-mRNA的加工成熟,mRNA（由细胞核至细胞质）的转运、定位、翻译和代谢等多个转录后环节,进而影响受遗传调控的植物生长、发育、增殖、分化、胁迫应答等生命过程。因此对RBPs及其编码基因的研究对于阐明植物的生长、发育及胁迫应答的机理十分重要。已有的研究表明,cpRBP29是由核基因编码并定位到叶绿体中的蛋白,叶绿体中,该类蛋白主要包括cpRBP28/ cpRBP29（a、b）/ cpRBP31（a、b）/ cpRBP33（a、b）这几大类,它们与叶绿体基因组编码的基因表达调控密切相关,同时还起着细胞（核基因组）和叶绿体（基因组）之间的信息传递和协调功能,但关于该基因对生长发育相关的生理作用则缺少相关的研究。许多环境因子会对植物的生长产生胁迫影响,是植物生长的胁迫因子。植物生长发育过程中不可避免地会受到（环境）胁迫因子的影响。重度的胁迫会对植物的生长发育造成伤害;在农业生产中则会降低农作物的产量、质量和经济效益。研究植物对胁迫的应答及调控机理对降低胁迫的不利影响,指导农业生产具有积极的意义。高盐是常见的胁迫因子,土壤盐渍化会严重抑制植物的生长和发育,影响农作物的品质和产量。盐对植物造成的胁迫同植物的离子运输密切相关,因此,研究植物的离子运输对理解植物耐盐的机理及调节至关重要。动物中的研究表明,NKCC是一类与盐腺泌盐功能密切相关的离子转运结构,它同Cl---Channel （氯离子通道）以及该基因家族的其它成员的编码产物如KCC、NCC协同配合对动物盐腺

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 一 盐胁迫和植物的耐盐性
• 1 植物的耐盐策略与研究概况
• 1.1 植物离子稳态的重建
• 1.1.1 植物对离子的吸收及调节
• + 跨膜内流'>1.1.1.1 Na⁺跨膜内流
• + 被动扩散'>1.1.1.1.1 Na⁺被动扩散
• + 的转运'>1.1.1.1.2 非选择性阳离子通道对Na⁺的转运
• +转运蛋白对Na⁺ 的转运'>1.1.1.1.3 高亲和K⁺转运蛋白对Na⁺的转运
• + 的吸收'>1.1.1.2 K⁺的吸收
• +吸收的两种机制'>1.1.1.2.1 K⁺吸收的两种机制
• + 运输的途径'>1.1.1.2.2 K⁺运输的途径
• + 吸收的调节机制'>1.1.1.2.3 K⁺吸收的调节机制
• - 的吸收和区隔化'>1.1.1.2.4 Cl^-的吸收和区隔化
• 2+ 的均衡'>1.1.1.2.5 Ca²⁺的均衡
• 1.1.2 植物体内离子稳态的重建——离子区隔化和离子的外排
• + 的区隔化'>1.1.2.1 Na⁺的区隔化
• 1.1.2.2 离子外排
• + 的外排'>1.1.2.2.1 Na⁺的外排
• 1.1.2.2.2 SOS 信号通路与离子稳态的调节
• 1.2 离子长距离运输
• 1.3 渗透稳态的重建
• 1.4 植物对水分的吸收和水分运输的调节
• 2 陆生植物对盐胁迫的适应
• 2.1 泌盐
• 2.2 稀盐
• 2.3 拒盐
• 二 RNA 结合蛋白对植物后转录功能的调控
• 1 RBP 的结构特点
• 2 RBP 的功能及分类
• 2.1 RBP 与mRNA 的可变剪接
• 2.1.1 可变剪接与基因表达的调控
• 2.1.2 可变剪接与蛋白质组多样性
• 2.1.3 可变剪接的机制
• 2.1.3.1 参与可变剪接的RNA 顺式作用元件
• 2.1.3.2 参与可变剪接的反式作用因子-RNA 结合蛋白
• 2.2 与可变剪接作用相关的RNA 结合蛋白
• 2.2.1 SR 蛋白
• 2.2.2 hnRNP 蛋白
• 2.2.3 snRNP 类蛋白
• 2.2.4 寡聚尿嘧啶特异性RNA 结合蛋白UBP1、RBP45、RBP47、UBA1 和 UBA2
• 2.2.5 其它RBP 类剪接因子及剪接因子间的相互作用
• 2.2.5.1 多聚嘧啶序列结合蛋白（PTB）
• 2.2.5.2 30K-RRM proteins
• 2.2.5.3 SR 蛋白和hnRNP A/B 蛋白在剪接位点选择中的拮抗作用
• 2.3 Poly（A）结合蛋白（PABPs）
• 2.4 富含甘氨酸的RNA 结合蛋白（GR-RBP）
• 2.5 RNA 结合蛋白与mRNA 的运输
• 2.6 RNA 结合蛋白与mRNA 的稳定性
• 2.7 叶绿体RNA 结合蛋白
• 2.7.1 叶绿体RNA 结合蛋白与mRNA 的稳定
• 2.7.2 叶绿体RNA 结合蛋白与mRNA 的转录调控
• 2.7.3 叶绿体中的cpRNP 类RNA 结合蛋白
• 2.8 RNA 结合蛋白与ABA 信号转导
• 第二部分 实验论文
• 第一章 实验材料及实验方法
• 1. 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种
• 1.3 质粒载体
• 1.4 酶及化学试剂
• 1.5 培养基
• 1.6 质粒提取液
• 1.7 主要仪器设备
• 1.8 引物序列
• 1.8.1 Th-cpRBP29 相关引物及序列
• 1.8.2 At-cpRBP 引物序列
• 1.8.2.1 At-cp RBP-Promoter 克隆引物
• 1.8.2.2 At-cp RBP 全长序列克隆引物
• 1.8.2.3 At-cpRBP29 基因沉默片段克隆引物
• 1.8.2.4 Bar Gene and Gus primer
• 1.8.3 编码PSII 亚单位相关基因的 QRT-PCR 引物
• 1.8.4 补血草NKCC 克隆兼并引物
• 1.8.5 补血草NKCC 沉默片段克隆引物
• 2 实验方法
• 2.1 植物总RNA 的提取
• 2.1.1 Trizol 试剂提取植物总RNA
• 2.1.2 异硫氰酸胍法提取总RNA
• 2.1.3 改良CTAB 法提取补血草总RNA
• 2.2 植物基因组DNA 提取
• 2.2.1 植物基因组DNA 大量提取法
• 2.2.2 微量法（SDS 法）提取植物基因组 DNA
• 2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.4 质粒的提取
• 2.5 基因的克隆与载体的构建
• 2.5.1 盐芥叶绿体RNA 结合蛋白Th-cpRBP29 的克隆
• 2.5.1.1 快速扩增Th-cpRBP29 cDNA 末端（5' RACE）
• 2.5.1.2 编码盐芥叶绿体RNA 结合蛋白基因Th-cpRBP29 全长序列的克隆
• 2.5.2 拟南芥RNA 结合蛋白基因At-cpRBP29 启动子及全长序列的克隆
• 2.5.2.1 拟南芥RNA 结合蛋白基因At-cpRBP29 Promoter 的克隆
• 2.5.2.2 拟南芥At-cpRBP29 全长cDNA 序列的克隆
• 2.5.2.3 拟南芥At-cpRBP29 RNAi 序列片段的扩增
• 2.5.3 补血草NKCC 的克隆
• 2.6 PCR 扩增/酶切产物的回收与pMD18-T 载体的连接
• 2.7 植物过量表达载体的构建
• 2.7.1 植物过量表达载体pCAMBIA3301::Th-cpRBP 的构建
• 2.7.1.1 质粒pRT101-Th-RBP 的构建
• 2.7.1.2 植物过量表达载体pCAMBIA3301::Th-RBP 的构建
• 2.7.2 盐芥Th-cpRBP RNAi 载体pGSA1252::Th-cpRBP 的构建
• 2.7.2.1 构建RNAi 载体的序列
• 2.7.2.2 盐芥Th-cpRBP RNAi 片段的克隆
• 2.7.2.3 Th-cpRBP29 RNAi 载体pGSA1252::Th-cpRBP29 的构建
• 2.7.3 盐芥GFP::Th-cpRBP29 植物表达载体的构建
• 2.7.3.1 PPK100-GFP::Th-cpRBP29 融合蛋白表达载的构建
• 2.7.3.2 pCAMBIA3301:: Th-cpRBP29-GFP 植物表达载体的构建
• 2.7.4 拟南芥Promoter::Gus 载体的构建
• 2.7.5 植物过量表达载体pGSA1252::At-cpRBP 及RNAi 载体的构建
• 2.7.5.1 At-cpRBP29 的克隆
• 2.7.5.2 植物过量表达载体pGSA1252::At-cpRBP 的构建
• 2.7.5.3 At-cpRBP RNAi 载体的构建
• 2.7.5.3.1 构建At-cpRBP RNAi 载体的核苷酸序列
• 2.7.6 中华补血草NKCC RNAi 载体pGSA1252:: Ls-NKCC 的构建
• 2.7.6.1 构建 RNAi 载体的序列
• 2.7.6.2 补血草 NKCC RNAi 载体的构建
• 2.8 植物表达载体的农杆菌转化
• 2.9 农杆菌质粒的提取与鉴定
• 2.10 菌种的保存
• 2.11 转基因植株的 PCR 检测
• 2.12 转基因植株的Southern 杂交分析
• 2.12.1 Southern 杂交用 DNA 尼龙膜的制备
• 2.12.2 cDNA 探针的制备
• 2.12.3 Southern 杂交过程
• 2.13 转基因植株的Northern 杂交分析
• 2.13.1 RNA 电泳
• 2.13.2 RNA 杂交膜的制备
• 2.13.3 Northern 杂交探针的制备
• 2.13.4 杂交过程
• 2.14 转化子的遗传分析
• 2.15 转基因拟南芥的处理
• 2.15.1 对照与转基因拟南芥植株MDA 含量的测定
• 2.15.2 对照与转基因拟南芥植株光合水平的测定
• 2.15.3 对照与转基因植株叶绿素含量的测定
• 2.15.4 实时定量PCR 操作及分析
• 2.15.5 蛋白双向电泳
• 2.15.5.1 植物总蛋白的三氯乙酸（TCA）丙酮制干粉提取法
• 2.15.5.2 蛋白质浓度的定量
• 2.15.5.3 样品水化等电聚焦
• 2.15.5.4 IPG 胶条的平衡
• 2.15.5.5 第二向垂直SDS-PAGE 电泳
• 2.15.5.6 染色及图像采集
• 3 补血草再生及遗传转化系统的建立
• 3.1 补血草再生体系的建立及优化
• 3.2 补血草叶圆盘法遗传转化系统的建立
• 3.2.1 活化菌种
• 3.2.2 补血草叶片的预培养
• 3.2.3 补血草叶片的转化
• 3.2.4 共培养
• 3.2.5 筛选培养
• 3.2.6 生根培养
• 3.2.7 移苗种植
• 3.2.8 转化植株的分子检测
• 3.3 原位杂交
• 第二章 结果与分析
• 1 盐芥Th-cpRBP29 的表达分析
• 1.1 不同时间低温（4℃）处理对盐芥Th-cpRBP29 表达的影响
• 1.2 不同时间高温（40℃）处理对盐芥Th-cpRBP29 表达的影响
• 1.3 200mM NaCl 处理对对盐芥Th-cpRBP29 表达的影响
• 2. 盐芥及拟南芥cpRBP29 的克隆、遗传转化和转基因植株的分子检测及遗传分析
• 2.1 盐芥Th-cpRBP29 全长序列的克隆
• 2.1.1 盐芥EST 库已有序列的分析
• 2.1.2 盐芥cpRBP29 基因5' RACE 结果
• 2.1.3 盐芥cpRBP29 全长序列的扩增
• 2.1.4 全长序列及编码的氨基酸列序
• 2.1.5 Blast 比对结果
• 2.1.6 盐芥Th-cpRBP29 基因与其它植物的Th-cpRBP29 基因的亲缘关系
• 2.1.7 植物表达载体的构建
• 2.1.7.1 植物表达载体pCAMBIA 3301-Th-cpRBP29 载体的构建
• 2.1.7.1.1 质粒pRT101-Th-cpRBP29 的构建
• 2.1.7.1.2 植物表达载体pCAMBIA 3301::Th-cpRBP29 的构建
• 2.1.7.2 Th-RBP29 RNAi 基因沉默载体的构建
• 2.1.7.2.1 Th-RBP 基因沉默载体上下游序列的克隆
• 2.1.7.2.2 Th-RBP 基因沉默载体的构建
• 2.1.7.3 Th-RBP29::GFP 载体的构建
• 2.2 植物表达载体的农杆菌转化和检测
• 2.3 转基因拟南芥/盐芥的分子检测
• 2.3.1 转基因拟南芥外源基因的检测
• 2.3.2 转基因植株外源Th-cpRBP29 基因表达的Southern 检测
• 2.3.3 转基因植株外源Th-cpRBP29 基因表达的Northern 检测
• 2.3.4 转基因盐芥的分子检测
• 2.4 拟南芥At-cpRBP29 序列、Promoter 的克隆及载体构建
• 2.4.1 拟南芥cpRBP29 的克隆及过量表达载体的构建
• 2.4.2 拟南芥cpRBP29 基因RNAi 沉默载体的构建
• 3 转基因拟南芥的分析
• 3.1 过量表达Th-cpRBP29 对拟南芥生长的影响
• 3.2 过量表达Th-cpRBP29 对萌发期转基因拟南芥耐盐性的影响
• 3.3 过量表达Th-cpRBP29 对转基因拟南芥抗氧化胁迫的影响
• 3.4 过量表达Th-cpRBP29 对转基因拟南芥渗透胁迫的影响
• 3.5 拟南芥At-cpRBP29 基因沉默对转基因拟南芥的功能影响
• 3.5.1 At-cpRBP29 基因沉默对转基因拟南芥生长的影响
• 3.5.2 At-cpRBP29 基因沉默对萌发期转基因拟南芥植株耐盐性的影响
• 3.5.3 At-cpRBP29 基因沉默对转萌发期基因拟南芥植株抗氧化胁迫的影响
• 3.6 不同植物激素处理对cpRBP29 转基因拟南芥种子萌发的影响
• 3.6.1 ABA 处理对cpRBP29 转基因拟南芥种子萌发的影响
• 3.6.2 细胞分裂素及生长素处理对cpRBP29 转基因拟南芥种子萌发的影响
• 3.7 At-cpRBP29 组织特异性表达分析
• 3.8 Th-cpRBP29 表达产物在细胞中的定位
• 3.9 转基因和野生型拟南芥中PSII 相关基因的实时定量PCR （QRT-PCR ）分析
• 3.10 野生型及异源过量表达Th-cpRBP29 对转基因拟南芥蛋白表达的影响
• 3.11 盐胁迫对cpRBP29 过量表达及沉默转基因植株MDA 的影响
• 3.12 低温对cpRBP29 过量表达及沉默转基因植株叶绿素及胡萝卜素含量的影响
• 3.13 盐处理对cpRBP29 过量表达及基因沉默转基因拟南芥叶绿素的含量的影响
• 3.14 盐处理对cpRBP29 过量表达及基因沉默转基因拟南芥PSⅡ光合效率的影响
• 3.14.1 不同盐浓度处理对cpRBP29 过量表达及基因沉默转基因拟南芥F0 光合效率的影响
• 3.14.2 不同盐浓度处理对cpRBP29 过量表达及基因沉默转基因拟南芥FV 的影响
• 3.14.3 不同盐浓度处理对cpRBP29 过量表达及基因沉默转基因拟南芥FV/FM 的影响
• 4 讨论
• 5 中华补血草NKCC 的克隆、沉默载体的构建及转化
• 5.1 中华补血草NKCC 的克隆
• 5.1.1 中华补血草NKCC 克隆用兼并引物组合
• 5.2 中华补血草NKCC 基因沉默载体的构建
• 5.3 中华补血草NKCC 组织特异性表达的检测—原位杂交
• 5.4 中华补血草再生及遗传转化体系的建立及优化
• 5.4.1 中华补血草再生体系的建立及优化
• 5.4.1.1 中华补血草再生培养基激素配比的优化
• 5.4.1.2 不定芽增殖
• 5.4.1.3 植物生长素对诱导不定芽生根的影响
• 5.4.1.4 试管苗移栽及管理
• 5.4.2 中华补血草遗传转化体系的建立
• 5.4.3 讨论
• 参考文献
• 英文缩写符号及中英对照表
• 攻读博士学位期间发表和整理的论文
• 致谢
• 附录