蛇床子素作为杀菌剂的活性研究

论文摘要

蛇床子素（Osthol,7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素）为来源于植物的天然化合物,被证实具有抗心律失常、增强免疫功能、抗炎、抗病毒、抗肝损伤等广泛的药理活性,对交链孢菌（Alternaria alternata）、新型隐球菌（Cryptococcusneoformans）及曲霉菌（Aspergillus sp.）等真菌具有抑制作用。论文作者发现蛇床子素对常见植物病原真菌具有广谱抑菌活性。本论文以专性寄生真菌南瓜白粉病菌（Sphaerotheca fuhginea）和腐生真菌小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）为材料,较为系统地研究了蛇床子素的抑菌与防病机制和其仿生合成衍生物抑菌谱,目的在于研究其作为农用杀菌剂的活性及前景。主要研究结果如下:1抑菌谱与农药活性测定离体条件下测得蛇床子素对多种常见植物病原真菌具有抑制活性,抑制中浓度(EC50值)大多在20μg·mL-1～60μg·mL-1之间。采用小株喷雾法和叶盘沾药法测定蛇床子素对南瓜白粉病菌EC50值分别为42.28和30.19μg·mL-1,且兼具良好的预防和治疗效果:100μg·mL-1蛇床子素（未加任何农药助剂）其预防效果为77.41%,治疗效果为68.72%。笔者所研制的1%蛇床子素水乳剂用量为33.75g.ai·hm-2时,对黄瓜白粉病防效分别达83.45～94.59%,高于对照药剂15%三唑酮可湿性粉剂,与进口杀菌剂10%世高水分散粒剂防效相当。2防病机理2.1对病原真菌作用显微观察发现蛇床子素对南瓜白粉病菌生长的各个时期都有影响:采用水琼脂平板和离体叶盘法统计发现100μg·mL-1蛇床子素在48h后对该菌分生孢子萌发抑制率90%以上并显著降低产孢量;采用DAB（二氨基联苯胺）染色法检测植物与病原菌互作过程中的细胞学定位,发现蛇床子素对分生孢子入侵的抑制率达75%,从而阻止分生孢子在寄主上定殖。显微观察表明该化合物可有效抑制南瓜白粉病菌菌丝生长,接菌48h后,对照菌丝平均长度接近400μm,而蛇床子素处理组菌丝平均长度仅有122μm。蛇床子素可能通过降低胞外酯酶的分泌来影响白粉病菌在寄主上的黏附而阻碍白粉病菌对营养的吸收。扫描电镜和透射电镜观察发现,蛇床子素能够引起白粉病菌菌丝体皱缩凹陷、细胞壁消融、细胞器溶解并伴随细胞内容物外泄,最终导致细胞死亡。但采用流式细胞仪检测和荧光显微观察,在短时间内未发现细胞膜通透性受到损伤,因此推断细胞膜可能并非蛇床子素最初的作用部位。采用对蛇床子素敏感性相当、也表现孢子萌发被抑制但可离体培养的腐生菌小麦赤霉病菌为材料研究抑菌的生化机制。结果表明液体培养条件下,以100μg·mL-1蛇床子素处理小麦赤霉菌24h,造成菌丝大量断裂。对细胞壁形成所需底物和细胞壁水解相关酶测定,结果表明蛇床子素处理后小麦赤霉菌体内几丁质酶活性、N-乙酰葡萄糖胺含量均升高,而β-1.6-葡聚糖酶活性与对照相比无显著变化。在培养基中加入14C标记葡萄糖,以100μg·mL-1蛇床子素处理小麦赤霉菌,结果表明菌体内葡萄糖含量迅速下降,3h时达到最低,为对照的51%,同时几丁质酶活性迅速升高为对照的3倍;由此推测可能由于糖饥饿诱导几丁质水解酶表达,引起几丁质前体水解,细胞壁形成受阻。以100μg·mL-1蛇床子素处理小麦赤霉菌后12h,处理菌体内钙含量仅为对照的60%并改变菌丝顶端钙离子梯度,表明蛇床子素能抑制菌体对钙的吸收,推测其可能影响到Ca2+依赖泡囊内含物运输释放到细胞壁过程,从而影响到菌丝顶端生长。2.2对寄主的作用除直接抑菌外,蛇床子素能够引起南瓜叶片内抗性相关酶类如几丁质酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性的增强。通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法研究了南瓜叶片内几丁质酶基因的转录情况,显示该化合物上调了叶片内几丁质酶基因的转录水平。其防病机理不仅表现在杀死白粉病菌、抑制其入侵过程的直接影响,而且可能诱导寄主的抗病能力提高。3其仿生合成衍生物的活性实验室合成了5个含吡喃环的蛇床子素衍生物,对蔬菜、果树、粮食上7种常见的病原真菌表现出一定活性,其中化合物JS-B对卵菌纲真菌辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）活性最高(其EC50值为41.78μg·mL-1),与蛇床子素对该菌的活性相当。化合物JS-B对辣椒疫霉病菌茵丝生长、孢子囊形成和释放游动孢子三种不同生长发育阶段都表现抑制作用。显微观察发现:JS-B能够引起辣椒疫霉菌丝形态发生异常,而蛇床子素处理的菌丝形态则无明显变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 杀菌剂的研究进展
• 1.1 杀菌剂的定义及分类
• 1.2 杀菌剂的研发历史
• 1.3 植物源杀菌剂
• 2 香豆素类化合物研究进展
• 2.1 香豆素类化合物生物活性
• 2.2 蛇床子素
• 3 瓜类白粉病危害及杀菌剂防治研究
• 3.1 病原菌的种类、特性、寄主范围及分布
• 3.2 杀菌剂防治白粉病
• 3.3 禾谷镰（刀）孢菌
• 4 香豆素类合成及蛇床子素仿生合成
• 4.1 香豆素类合成研究
• 4.2 蛇床子素分子结构及其结构类似物
• 5 本研究的立题依据与目的意义
• 第二章 蛇床子素生物活性测定及田间药效
• 第一节 蛇床子素抑菌谱测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第二节 1%蛇床子素水乳剂防治黄瓜白粉病田间药效试验
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第三章 蛇床子素对南瓜白粉病的防治机理
• 第一节 蛇床子素对南瓜白粉病的防、治试验
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第二节 蛇床子素对白粉病菌入侵过程的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第三节 蛇床子素对白粉病菌菌体形态的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第四节 蛇床子素对南瓜白粉病菌寄主的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第五节 本章结论与创新之处
• 第四章 蛇床子素抑制植物病原真菌生化机制
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株和药剂
• 1.2 蛇床子素处理小麦赤霉菌丝形态的观察
• 1.3 蛇床子素对小麦赤霉病菌孢子萌发影响的观察
• 1.4 蛇床子素处理菌丝干重的测定
• 1.5 蛇床子素处理液体培养菌丝形态的观察
• 1.6 经蛇床子素处理小麦赤霉病菌菌体内含物测定
• 2 结果与分析
• 2.1 蛇床子素对小麦赤霉病菌菌丝形态影响
• 2.2 蛇床子素对小麦赤霉病菌丝干重的影响
• 2.3 蛇床子素对小麦赤霉孢子萌发的抑制作用
• 2.4 蛇床子素对小麦赤霉菌丝形态影响
• 2.5 蛇床子素处理后几丁质酶活性、N-乙酰-D葡萄糖胺含量和葡聚糖酶活性的变化
• 2.6 蛇床子素处理小麦赤霉菌丝体内葡萄糖的变化
• 2.7 蛇床子素处理后小麦赤霉菌体可溶性蛋白质和蛋白酶活性的变化
• 2.8 蛇床子素对小麦赤霉菌ATPase离体抑制
• 2+吸收的影响'>2.9 蛇床子素对小麦赤霉菌Ca²⁺吸收的影响
• 2+分布'>2.10 小麦赤霉病菌菌丝体内Ca²⁺分布
• 3 结论与讨论
• 3.1 蛇床子素处理造成小麦赤霉病菌丝大量断裂
• 3.2 蛇床子素抑制小麦赤霉病菌对钙吸收机制
• 3.3 蛇床子素对小麦赤霉病菌能量代谢产生抑制
• 第五章 蛇床子素衍生物的抑菌活性
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试化合物
• 1.3 抑制率和抑菌谱测定
• 1.4 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌孢子囊产生的抑制作用
• 1.5 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌孢子囊释放的作用
• 1.6 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌菌丝形态影响
• 1.7 不同pH对化合物JS-B抑制辣椒疫霉菌丝生长的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 JS-A（B，C，D，E）对几种植物病原真菌抑制率测定
• 2.2 JS-B对几种植物病原真菌毒力回归方程测定
• 2.3 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌菌丝径向生长的抑制作用
• 2.4 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌孢子囊产生的抑制作用
• 2.5 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌孢子囊释放的抑制作用
• 2.6 化合物JS-B对辣椒疫霉病菌菌丝形态的影响
• 2.7 不同pH值对化合物JS-B抑制辣椒疫霉菌丝生长的影响
• 3 结论与讨论
• 全文总结
• 本研究的创新之处
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及专利目录