高迁移率族蛋白B-1在压力超负荷心肌肥厚中的作用及信号通路研究

论文摘要

心肌重构是多种心脏疾病的发生基础，如缺血性心肌病及高血压心脏病等都伴随明显的心脏结构改变。炎症细胞及炎症相关因子的作用在心血管疾病发病机制的研究上已受到越来越多的关注和重视。现已发现，炎症因子参与心肌重构的病理过程，但其在不同病因诱导的心肌重构中所发挥的作用不尽相同。机械压力的刺激及神经体液因素的影响在高血压心肌肥厚形成过程中至关重要。此外，研究发现高血压时不仅心肌内肥大细胞增多‘、外周血单核细胞也得到激活邑。。因此，人们逐渐认识到，白细胞介素（IL-1、IL-6、IL-8）、肿瘤坏死因子a（TNF-Q）、C反应蛋白（CRP）等多种炎症因子都与高血压密切相关帕，并可能参与形成高血压心肌肥厚卜m。如压力超负荷能促进心肌细胞表达TNF-Q，而阻断TNF-Q不仅可以减轻压力超负荷条件下的炎症反应，还能抑制心肌肥厚形成。高迁移率族蛋白B-1（HMGBl）是一种重要的致炎因子，广泛分布于各种组织细胞。当细胞受到损伤或刺激时，其主动或被动分泌到细胞外后刺激单核细胞和内皮细胞释放TNF-Q、IL-6、IL-8等炎症因子，而这些炎症因子又可以正反馈促进HIGBl分泌”。。，并增加内皮细胞表面粘附分子表达，发挥炎症放大作用，这对延长和维持炎性反应至关重要埔。因此，我们推测HMGBl可能也参与高血压心肌损伤，并促进心肌肥厚的发生与发展。本研究首先针对慢性心力衰竭患者心脏功能及结构与炎症因子之间的关系进行讨论，旨在通过结合体内、外实验，观察以I-NGBl为代表的炎症因子在压力超负荷心肌肥厚中的作用并探讨其受体信号通路，从而进一步阐明高血压心肌肥厚的发病机制，为该疾病的防治提供新的理论依据第一部分慢性心力衰竭患者心脏功能及结构与炎症因子之间的关系研究目的采用Meta分析方法系统评价具有抗炎作用的他汀类药物对慢性心力衰竭患者血清炎症因子与心脏功能及结构的影响。方法系统检索PubMed、Medline、EMBASE、EBM Reviews databases等数据库。由两名研究者独立筛选以观察他汀类药物对慢性心力衰竭患者心脏功能、结构及血清炎症因子影响为目的的随机化对照研究,并提取相关数据加以分析。采用随机化效应模型进行荟萃分析,并用权重均差（WMD）／标准化均差（SMD）及95%可信区间（95%CI）加以量化。结果共检出相关文献4209篇,筛选出符合纳入标准的文献共14篇,涉及慢性心衰总病例数6265例。荟萃分析显示,与对照组相比,他汀类药物可明显提高心衰患者左室射血分数（LVEF, WMD=3.35%,95%CI=0.80～5.91%, P=0.01）,显著减小左室舒张末期内径（LVEDD, WMD=-3.77mm,95%CI=-6.24～-1.31mm, P=0.003）,以及左室收缩末期内径（LVESD, WMD=-3.57 mm,95%CI=-6.37～-0.76mm, P=0.01）。另外,他汀类药物还能明显降低心衰患者血清B型脑钠肽水平（BNP, WMD=-83.17pg/ml,95%CI=-121.29～-45.05 pg/ml, P<0.0001）和NYHA分级（WMD=-0.30,95%CI=-0.37～-0.23, P<0.00001）。在对血清炎症相关因子的作用方面,他汀类药物不仅对降低心衰患者高敏C反应蛋白水平上有效（hsCRP, SMD=-0.74,95%CI=-1.16～-0.32, P=0.0005）,还能降低可溶性血管细胞粘附因子1（sVCAM-1, SMD=-0.49,95%CI=-0.91～-0.08, P=0.02）。Meta回归及亚组分析表明,患者年龄、病因、基础LVEF、他汀药物种类,以及随访时间等因素都可能影响他汀类药物对慢性心衰患者的作用,且较短期治疗而言（<1年）,他汀类药物长期治疗（≥1年）可能更有利于降低心衰患者hsCRP及白细胞介素6（IL-6）水平,同时他汀类药物提高LVEF的作用也呈明显时间依赖性（P=0.03）。结论他汀类药物不仅能降低慢性心力衰竭患者血清炎症因子表达水平,还可能改善心室重构、增强心脏功能,并缓解临床症状,且心衰患者血清炎症因子降低更明显的同时,可能心功能增强也越显著,提示慢性心衰患者心脏功能及结构可能与血清炎症因子表达水平密切相关。第二部分压力超负荷小鼠模型构建及其心脏组织中高迁移率族蛋白B-1的变化目的利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型,并观察压力超负荷对小鼠心脏组织中炎症因子高迁移率族蛋白B-1（HMGB1）表达的影响。方法利用主动脉弓缩窄（TAC）方法在8-10周龄野生型雄性健康成年C57BL/6小鼠体内构建压力超负荷模型（缩窄比例约为70%）,并按TAC不同时间随机分为6组：TAC-0天（对照）；TAC-1天；TAC-3天；TAC-7天；TAC-14天；TAC-28天。行小鼠经胸心脏超声检测,观察心脏功能及形态变化,并同时测定小鼠主动脉及左心室压力。上述检测后,观察离体心脏大小并计算心重／体重比（mg/g）。垂直心脏长轴制作小鼠心脏石蜡切片,经苏木精-伊红（HE）染色和马森（Masson）染色观察心脏形态、心肌细胞大小,以及纤维化程度改变。应用蛋白免疫印迹法（Western Blot）及免疫组织化学染色法（IHC）检测心脏HMGB1表达水平及表达部位。另外,本研究还借助细胞培养牵张装置在体外模拟压力超负荷,检测牵张刺激对心肌细胞内HMGB1表达水平的影响。结果TAC术后1天至28天,小鼠主动脉收缩压及左心室收缩末压均较对照组显著升高（P<0.01）,且升高幅度未见明显变化。心超结果显示,TAC术后1天、3天及28天时,左室射血分数及左室缩短分数较对照明显降低（P<0.01）；左心室容积与内径也发生类似改变（P<0.05）；TAC术后14天时,收缩末期及舒张末期左心室前壁与后壁均明显增厚（P<1.01）。观察离体心脏发现,心脏在TAC术后14天及28天时明显扩大,心重／体重比检测也进一步证实该变化（P<1.05）。HE染色同样发现,TAC术后1天和3天时左心室腔较对照稍扩大,28天时明显扩大,而在14天时则呈现向心性肥厚,且心肌细胞横截面面积（CSA）显著增大（P<0.01）。Masson染色结果表明,心脏在TAC术后14天开始出现轻微纤维化改变,并于28时显著加重。Western Blot与IHC结果显示,TAC术后3天及7天时,心脏组织高迁移率族蛋白B-1（HMGB1）表达水平显著升高（P<0.05）,且由细胞核转移至细胞浆和细胞外。另外,机械牵张心肌细胞12小时后可见细胞内HMGB1水平明显升高（P<0.05）。结论本研究成功利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型。小鼠左心功能在TAC术后3天内受抑,之后逐渐恢复正常,至2周时出现代偿性心肌肥厚,并于4周时进入失代偿状态。压力超负荷可引起心脏组织中HMGB1表达增加及活化,且增加的HMGB1可能来源于心肌细胞。第三部分高迁移率族蛋白B-1对压力超负荷小鼠心肌肥厚的影响及可能机制目的观察高迁移率族蛋白B-1（HMGB1）对压力超负荷小鼠心脏功能及结构的影响,并初步探讨其作用机制。方法利用主动脉弓缩窄（TAC）方法在8-10周龄野生型雄性健康成年C57BL/6小鼠体内构建压力超负荷模型（缩窄比例约为70%）并／或采用心肌内注射法在小鼠心脏中注射PBS或HMGB1重组蛋白。按不同干预措施将小鼠分为4组：假手术组；HMGB1组；TAC+PBS组；TAC+HMGB1组。分别于2周及4周时行小鼠经胸心脏超声检测,观察心脏功能及形态变化,并同时测定小鼠主动脉及左心室压力。上述检测后,观察离体心脏大小并计算心重／体重比（mg/g）。垂直心脏长轴制作小鼠心脏石蜡切片,经苏木精-伊红（HE）染色和马森（Masson）染色观察心脏形态、心肌细胞大小,以及纤维化程度改变。应用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测心脏组织磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERKl/2）和磷酸化信号转导及转录活化因子3（p-STAT3）表达水平。结果与假手术组相比较,单纯心肌内注射HMGB1未对血压造成影响,而TAC术后小鼠主动脉收缩压及左心室收缩末压在2周和4周时均明显升高（P<0.01）心超检测发现,2周时,TAC+HMGB1组小鼠左室射血分数（LVEF）及左室缩短分数（LVFS）较其余各组显著增高（P<0.05）,左室收缩末期及舒张末期容积则较假手术组明显减小（P<0.05）；与假手术组小鼠比较,TAC+PBS组及TAC+HMGB1组小鼠左室收缩末期和舒张末期前壁及后壁厚度明显增加（P<0.01）,且TAC+HMGB1组小鼠较TAC+PBS组小鼠更厚（P<0.01）。4周时,HMGB1组.TAC+PBS组及TAC+HMGB1组LVEF及LVFS均明显较假手术组降低（P<0.05）,且TAC+HMGB1组较TAC+PBS组低（P<1.05）；HMGB1组、TAC+PBS组及TAC+HMGB1组左室收缩末期容积均较假手术组小鼠明显增加（P<0.05）,且TAC+HMGB1组左室舒张末期内径较假手术组小鼠明显增加（P<0.05）；HMGB1组小鼠左室收缩末期前壁及后壁厚度均较假手术组小鼠明显变薄（P<0.05）,而TAC+PBS组及TAC+HMGB1组室壁厚度较2周时变薄（P<0.01）。2周及4周时,TAC+PBS组及TAC+HMGB1组小鼠离体心脏明显增大,且心重/体重比明显大于假手术组（P<0.05）。HE染色与心超检测结果一致,2周时TAC+PBS组小鼠心肌细胞CSA较假手术组明显增大（P<0.01）,且TAC+HMGB1组最大（P<0.01）。Masson染色结果提示,HMGB1可以直接导致并加重压力超负荷心肌纤维化。Western Blot结果显示,2周时TAC+HMGB1组小鼠心脏组织中p-ERKl/2及P-STAT3表达水平较TAC+PBS组增高,且两组均高于假手术组。结论压力超负荷促使小鼠发生代偿性心肌肥厚,并最终导致心功能不全。HMGB1可加重压力超负荷所致小鼠心肌肥厚、心肌纤维化以及心功能不全,且该作用可能与ERK1/2信号通路及STAT3信号通路有关。第四部分高迁移率族蛋白B-1对心肌细胞作用的受体信号通路研究目的观察高迁移率族蛋白B-1对心肌细胞内肥厚相关蛋白表达的影响,并探讨其受体信号通路。方法利用1-2日龄SD大鼠分离、培养心肌细胞,借助细胞培养牵张装置在体外对心肌细胞进行机械牵张刺激,以模拟压力超负荷。对心肌细胞进行机械牵张和／或HMGB1 （100ng/ml）刺激1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时,以及24小时后检测细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）、P38激酶（p-P38）、Janus激酶2（p-JAK2）、信号转导及转录活化因子3（p-STAT3）,以及晚期糖基化终末产物受体（RAGE）和Toll样受体4（TLR-4）表达变化。此外,在阻断RAGE或TLR-4条件下,对心肌细胞给予HMGB1 （100ng/ml）刺激30分钟后检测上述激酶的变化。结果机械牵张刺激或HMGB1刺激在1小时内均能显著上调心肌细胞内磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）、磷酸化P38激酶（p-P38）、磷酸化Janus激酶2（p-JAK2）及磷酸化信号转导及转录活化因子3（p-STAT3）蛋白表达水平（P均<1.05）,且在激活心肌细胞内ERK1/2上,机械牵张和HMGB1刺激具有明显的协同作用（P<0.05）。其次,机械牵张刺激在24小时内可明显诱导心肌细胞RAGE和TLR-4受体蛋白表达水平升高（P<0.05）。另外,通过阻断心肌细胞表面RAGE或TLR-4受体后发现,部分阻断RAGE受体可有效抑制HMGB1上调细胞内p-ERK1/2的作用（P<0.05）,而对P-JAK2及P-STAT3表达无明显影响；部分阻断TLR-4受体对HMGB1的上述作用均无明显影响。结论机械牵张刺激可上调心肌细胞RAGE受体及TLR-4受体表达水平。与机械牵张刺激相似,HMGB1可激活心肌细胞内MAPKs及JAK2/STAT3,且该作用可能部分由RAGE介导。

论文目录

• 英文缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究创新点与意义
• 前言
• 第一部分 慢性心力衰竭患者心脏功能及结构与炎症因子之间的关系研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 压力超负荷小鼠模型构建及其心脏组织中高迁移率族蛋白B-1的变化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 高迁移率族蛋白B-1对压力超负荷小鼠心肌肥厚的影响及可能机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 高迁移率族蛋白B-1对心肌细胞作用的受体信号通路研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 小结
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 附1、研究生期间科研成果及荣誉
• 附2、代表性SCI论文
• 致谢