论文题目: 根霉纤溶酶发酵过程优化及其溶栓作用的试验研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 刘东
导师: 路福平
关键词: 纤溶酶,根霉,发酵,分离提纯,优化,急性毒性,溶栓
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 心脑血管疾病严重威胁人类生命和健康,已经成为我国的主要死亡原因,且发病率近年来呈增长趋势。据近期全国卫生部门统计资料显示,我国现有缺血性脑血管疾病患者500余万人,每年新发病150万人,死亡20余万人,存活者中50%-70%病人遗留瘫痪、失语等严重残疾,给社会和家庭带来严重负担。大量的动物和临床试验均证明溶栓治疗对降低致死率和致残率具有显著作用,但目前临床使用的溶栓药物存在许多缺陷,因此研制高效、快速、副作用小,价廉的新型溶栓药物的需求迫切。微生物是获得溶栓剂的重要来源。 本论文在以前小型发酵的基础上,对根霉纤溶酶的液体和固体发酵工艺进行优化,同时对根霉纤溶酶的急性毒性作用和根霉纤溶酶的药效进行了动物试验。 根霉纤溶酶液体发酵工艺放大试验,研究表明在5L发酵罐试验中,20%接种量,发酵60h,初始pH为4.3时酶活力较高,达到25U/ml。发酵28h后温度变为26℃比30℃恒温发酵的产酶效果好。 采用中国根霉12#进行了固态放大发酵试验,结果表明初始湿度为0.75mL/g含水量,发酵湿度控制在70%,接种量1×107个/g,发酵前30h通风量为0.8vvm,发酵30h后通风量为0.7vvm,30℃发酵时间60h,产酶活力最高。 研究并确定了分离根霉纤溶酶的制备色谱优化工艺流程。根据目标酶的基本性质,选择了载量大、制备速度快的疏水层析色谱及强阳离子交换色谱模式并进行合理组合,确定的目标酶色谱分离流程为Octyl-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose HP、SP-Sepharose HP。用高分离度Resource Phe色谱和SDS-PAGE方法检验得到的根霉纤溶酶纯度,证明其组分均一,并达到电泳纯。 本研究表明,用最大浓度最大给药量对动物尾静脉注射后,连续14天观察未见动物死亡。测得根霉纤溶酶对小鼠静脉给药途径的LD50应为最大耐受剂量,大于25.0g/kg.bw,动物解剖后,与正常对照组比较,大体观察胸腹腔未见积液,肝、肾、脾、胃肠、肺、心脏大小、外观、色泽未见异常,无充血、出血、水肿变化,说明该药实际无毒。 将雌雄Wistar大鼠通过电流损伤法制成血栓模型,结果显示,肉眼可见颈
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 血栓性疾病、凝血与纤溶
1.1.1 血栓性疾病
1.1.2 凝血
1.1.3 纤溶
1.2 纤溶酶类溶栓剂应用状况
1.2.1 链激酶(streptokinase，SK)
1.2.2 尿激酶(urokinase，UK，u-PA)
1.2.3 组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator，t-PA)
1.2.4 对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(anisoylated plasminogen streptokinase activator complex，APSAC)
1.2.5 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single chain urokinase type plasminogen activator，scu-PA)
1.3 纤溶酶类溶栓剂研究开发状况
1.3.1 重组t-PA的突变体、组建嵌合型、单抗导向溶栓剂、葡激酶
1.3.2 动物来源纤溶酶
1.3.3 植物来源纤溶酶
1.3.4 海洋生物来源纤溶酶
1.3.5 微生物来源纤溶酶
1.4 抗血栓药研究动向
1.5 课题来源及本论文需要解决的问题
第二章 根霉纤溶酶液态发酵的工艺放大试验
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株和培养基
2.2.2 主要材料
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要设备
2.2.5 方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 不同接种量对产酶的影响
2.3.2 变温发酵对产纤溶酶的影响
2.3.3 液态发酵产纤溶酶生长曲线和产酶曲线
2.3.4 Octyl-Sepharose Fast Flow(5.5×40cm)疏水层析
2.3.5 Phenyl-Sepharose HP(2.6×20cm)疏水层析
2.3.6 SP-Sepharose HP(3.5×20cm)离子交换层析
2.3.7 Resource PHE(1.6×20cm)疏水层析
2.3.8 根霉纤溶酶纯度的电泳鉴定
2.3.9 纤溶酶纯化回收情况
2.4 本章小结
第三章 根霉纤溶酶固态发酵工艺放大试验
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株
3.2.2 主要材料
3.2.3 主要试剂
3.2.4 主要设备
3.2.5 培养基
3.2.6 培养方法
3.2.7 酶的浸提、超滤浓缩和盐析
3.2.8 疏水相互作用层析(φ8.0×60cm)
3.2.9 超滤脱盐
3.2.10 离子交换层析(φ5.5×40cm)
3.2.11 盐析浓缩
3.2.12 凝胶过滤层析(2.6×100cm)
3.2.13 纤溶酶纯度的检验
3.2.14 根霉纤溶酶最适作用pH
3.2.15 根霉纤溶酶最适作用温度
3.2.16 根霉纤溶酶pH稳定性
3.2.17.根霉纤溶酶热稳定性
3.2.18 根霉纤溶酶稳定性的提高和贮存条件
3.2.19 蛋白质浓度的测定
3.2.20 根霉纤溶酶的N端序列测定：
3.3 结果与讨论
3.3.1 培养基的含水量和湿度对根霉纤溶酶产量的影响
3.3.2 温度对根霉固态发酵纤溶酶产量的影响
3.3.3 通气量对根霉固态发酵纤溶酶产量的影响
3.3.4 接种量对根霉纤溶酶产量的影响
3.3.5 硫酸铵分级盐析
3.3.6 Octyl-Sepharose Fast Flow(φ8.0×60cm)疏水层析
3.3.7 DEAE-Sepharose Fast Flow(φ5.5×40cm)离子交换层析
3.3.8 Sephadex G-75(φ2.6×100cm)凝胶过滤
3.3.9 根霉纤溶酶纯度的电泳鉴定
3.3.10 纤溶酶纯化回收情况
3.3.11 根霉纤溶酶最适作用pH
3.3.12 根霉纤溶酶pH稳定性
3.3.13 根霉纤溶酶热稳定性
3.3.14 化学物质对酶的稳定性的影响
3.3.15 根霉纤溶酶的保存
3.3.16 根霉纤溶酶的N端氨基酸测定
3.4 本章小结
第四章 根霉纤溶酶急性毒性作用试验
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 待测样品
4.2.2 试验动物
4.2.3 实验动物环境
4.2.4 试验方法
4.3 试验结果
4.3.1 中毒症状观察
4.3.2 体重变化和死亡率
4.3.3 病理检查结果
4.3.4 LD_(50)测定
4.3.5 讨论
4.4 本章小结
第五章 根霉纤溶酶溶栓作用的试验研究
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 血栓动物模型的建立
5.3.2 根霉纤溶酶对大鼠颈动脉血栓的影响
5.3.3 大鼠颈动脉血管利脑组织电镜下病理改变
5.3.4 根霉纤溶酶体内血栓溶解实验
5.3.5 纤维蛋白溶解活性测定
5.3.6 根霉纤溶酶对兔血小板聚集率的影响
5.3.7 根霉纤溶酶对大鼠血清SOD利MDA的影响
5.3.8 根霉纤溶酶对大鼠血流变学影响
5.4 本章小结
第六章 全文总结与展望
6.1 全文总结
6.2 创新点
6.3 展望
致谢
攻读博士学位期间发表论文情况
发布时间: 2007-01-10
参考文献
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- [2].两种新型多功能纤溶酶的鉴定及其分子生物学特性研究[D]. 高柱虎.武汉大学2004
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- [4].一种新型海洋纤溶酶的研究[D]. 王佃亮.中国海洋大学2006
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