论文摘要
1956年我国方定一在扬州发现小鹅瘟（Goose plague，GP），1961年用鹅胚分离病毒并命名为小鹅瘟病毒（GP Virus，GPV），后定名为鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）。GPV侵害雏鹅和4-8周龄小鹅及雏番鸭（Muscovy Ducklings），传染性强、传播迅速、死亡率达90％以上，严重危害水禽业发展。德、匈、荷、法、英、意、以、日、南、前苏联、和越南等国家有GPV爆发流行文献报道。2004年，ICTV八次报告将GPV新分类为细小病毒亚科（Parvovirinae）依赖病毒属（Dependovirus）。同属成员中还有番鸭三周病的病原，即番鸭细小病毒（Moscovy duck parvovirus，MDPV）。文献报道，MDPV只引起番鸭发病，且与GPV引起的番鸭病十分相似。MDPV与GPV基因组同源性很高，为81.9％，常规血清学方法和分子生物学技术难以区分它们。近年来，我国鹅及番鸭养殖规模发展迅速，疫病危害愈来愈重，生产实际中非常需要能将GPV与MDPV从病原及其抗体进行鉴别诊断的技术。1、本文报道建立的GPV特异PCR方法。用Limn CK报道的AL18R2／AL18F2引物和CHUCY报道的GPVR／GPVF引物，对GPV和MDPV参考毒株进行GPV VP3基因中806bp片段和VP1全基因序列（大小为2206bp）扩增，均获得了阳性结果。纯化的PCR产物核苷酸序列比对发现，AL18R2／AL18F2引物PCR扩增产物与GenBank中的GPV强毒B株（U25749）和MDPV GD株（AY510603）基因同源性分别为97％和99％，两个病毒PCR产物之间同源性仅为81.1％。GPVF／GPVR引物PCR扩增产物与GPV强毒B株和MDPV GD株比较，同源性分别为97％和99％，两产物之间的同源性仅为80.3％。结果表明，引物AL18R2／AL18F2和引物GPVF／GPVR建立的PCR检测技术在结合PCR产物DNA序列测定时可以从基因水平区别GPV和MDPV。PCR及其产物序列测定结合起来的技术被称为PCRS（PCR and sequencing）。应用中我们体会到，PCRS费时（8天），费用高，每样试剂费80元以上，实际推广应用难度大。为此，根据Zoltan Z报道，新设计引物HJU／HJL，结果是PCR检测时只有GPV参考株出现阳性条带，而MDPV参考株则为阴性。经测序验证，GPV参考株PCR产物与GPV强毒B株核苷酸同源性为99％。采用新引物HJU／HJL PCR技术，勿需DNA序列测定即可确诊GPV，特异，快速（30小时），费用低，每样试剂费29元。2、运用我们建立的GPV特异PCR方法，对自然发病小鹅组织中病毒分布进行检测。4只11日龄病死小鹅胰腺（75％）、十二指肠（75％）和肺（75％）检出阳性；4只48日龄病死鹅心、肝、脾、肺、肾、胰腺和脑组织阳性检出率为100％，十二指肠为66.7％。结论是，临床诊断时胰腺胰腺、肺、肾和十二指肠组织病料阳性检测率高。本文确诊48日龄鹅的小鹅瘟，如此大日龄鹅发病，值得重视和研究。3、来自四川、广东、广西、重庆四省市的鹅病料13份，采用AL18R2／AL18F2引物和GPVF／GPVR引物检测，阳性样品数分别为8份和4份。将AL18R2／AL18F2引物PCR扩增的8份阳性PCR产物DNA序列与GPV强毒B株比较，同源性为96.20％～98.59％，推导的蛋白质氨基酸同源性为95.6％～100％，核苷酸变异率较高的位点有8处，即3212bp、3891bp、3828bp、3824bp、3723bp、3442bp、3410bp和3345bp处；氨基酸变异位点有2个，即VP蛋白463位的甘氨酸（G）变成了丝氨酸（S），485位的苏氨酸（T）变成了丙氨酸（A）。GPVF／GPVR引物扩增的2份PCR阳性产物DNA序列与GPV强毒B株比较，核苷酸同源性为96.0％和96.3％，推导的氨基酸同源性为95.3％和95.2％。核苷酸变异主要位于3899bp～4032bp序列（多达12处变异）和VP1与VP2起始密码子之间的区域，即2560bp～2844bp内（8处变异）。氨基酸变异位点有6个，分别位于VP蛋白的第207、210、525、528、562和707位。亲水性和抗原性分析表明，来自4个省市的8份GPV样品变异很小或没有变异。4、鸭胚致弱的GPV SRW毒株鸭胚尿囊液经氯仿处理，PEG6000沉淀，Sephadex G-200层析纯化制备的GPV抗原，以41.75μg／ml浓度包被后，加入待检血清，以后依次加入兔抗鹅IgG（1：400）和山羊抗兔酶标抗体（1：60000）反应，最后加入底物溶液的ELISA方法检测。20～40日龄小鹅经SRW弱毒油乳剂抗原免疫接种后，血清中GPV抗体效价于首免后第4、5周（即2免后第2、3周）达到高峰，以后下降，但抗体阳性结果可维持12周。
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