菌株HD-010抗辣椒根腐病菌活性产物发酵条件的研究

论文摘要

菌株HD-010为微生物学黑龙江省高校重点实验室从黑龙江地区土壤中自行分离得到的一株对辣椒根腐病菌拮抗性较好的链霉菌（ Streptomyces sp.）。是一株极具开发潜力的生防菌株。本研究旨在通过单因子试验和响应面优化法对链霉菌菌株HD-010的摇瓶发酵条件进行优化,以进一步提高其代谢活性物质的含量,并为进一步的应用研究奠定基础。本试验首先测定了几种发酵培养基对HD-010菌株活性产物的影响。确定最好的发酵培养基配方为:葡萄糖20g/L,蔗糖25 g/L,黄豆粉50g/L,NaCl 4g/L,CaCO3 3g/L,K2HPO40.2g/L,pH7.0,2%接种量,装液量为30mL/250 mL三角瓶,摇瓶转速为180r/min,发酵温度为28℃,发酵5d。通过单因子试验方法,确定了葡萄糖作碳源,玉米粉作氮源,加入Ca2+和Na+有利于菌株HD-010产生抗菌活性物质。根据单因素的初步试验结果,采用Plackett-Burman试验设计对培养基成分及培养条件进行筛选,得到4个显著因素,分别为葡萄糖、蔗糖、玉米粉和接种量。对前3个因素进行下一步的中心组合试验,对菌株HD-010发酵培养条件进行优化,建立了摇瓶发酵培养基配方筛选模型: Y=55.20-1.59A-1.77B+7.89C+0.68AB-2.72AC-4.82BC+1.05A2-0.96B2-5.68C2（A、B、C分别为葡萄糖、蔗糖、玉米粉,Y为响应值即抗菌活性物质的效价值。）根据此方程由Design-Expert 7.1.3软件设计确定最优发酵培养基和条件为:葡萄糖10g/L,蔗糖10.2g/L,玉米粉25.8g/L,氯化钠1g/L,碳酸钙1g/L,pH8.0,6%接种量,装液量为30mL/250 mL三角瓶,摇瓶转速为250r/min,发酵温度为28℃,发酵5d。其理论预测值为66.22AU/mL。通过验证试验结果表明:菌株HD-010产生的抗菌活性物质实际效价的平均值为71.38AU/mL,与预测值66.22AU/mL较接近,预测精度达到了92.78%,这表明试验值和实际值间有较好的拟合性,优化模型可靠。采用此优化配方菌株HD-010最终效价比原始发酵培养基发酵所得到的效价提高了55.28%。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 辣椒根腐病简介
• 1.1.1 辣椒根腐病的病原及症状
• 1.1.2 辣椒根腐病的发病规律
• 1.2 辣椒根腐病防治方法及现状
• 1.2.1 抗病育种
• 1.2.2 耕作栽培措施
• 1.2.3 化学药剂防治
• 1.2.4 生物防治
• 1.3 土传病害拮抗微生物的研究概况
• 1.3.1 细菌
• 1.3.2 真菌
• 1.3.3 放线菌及抗生素
• 1.4 抗菌活性产物发酵条件优化的方法和原理
• 1.4.1 培养基成分的优化
• 1.4.2 培养条件的优化
• 1.4.3 微生物发酵工艺优化策略概述
• 1.4.4 数据处理策略
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 主要药品及试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 拮抗菌株的选择
• 2.2.2 斜面培养基的选择
• 2.2.3 原始发酵培养基的选择
• 2.2.4 菌种的培养与保藏
• 2.2.5 孢子悬浮液的制备
• 2.2.6 菌体生长曲线的测定
• 2.2.7 抗菌活性物质生成时间的确定
• 2.2.8 抗菌活性物质效价的测定
• 2.2.9 菌种复壮
• 2.2.10 单因子试验
• 2.2.11 响应面法优化发酵条件
• 2.2.12 稳定性测定
• 第3章 结果与分析
• 3.1 拮抗菌株的选择
• 3.2 菌株HD-010 斜面培养基的选择及培养时间的确定
• 3.3 原始发酵培养基的选择
• 3.4 菌体生长曲线的绘制
• 3.5 抗菌活性物质生成曲线
• 3.6 标准曲线的绘制
• 3.7 单因素实验结果
• 3.7.1 接种龄的确定
• 3.7.2 接种量对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.3 最佳碳源的确定
• 3.7.4 最佳碳源不同浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.5 最佳氮源的确定
• 3.7.6 最佳氮源不同浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.7 NaCl 浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3 浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响'>3.7.8 CaCO₃ 浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 2HPO₄ 浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响'>3.7.9 K₂HPO₄ 浓度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.10 装液量对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.11 摇床转速对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.12 培养基的初始pH 值对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.7.13 温度对菌株HD-010 产抗菌物质的影响
• 3.8 响应面法优化发酵条件
• 3.8.1 Plackett-Burman 设计筛选显著因子
• 3.8.2 中心组合试验设计
• 3.8.3 响应面回归分析
• 3.9 验证试验
• 3.10 稳定性试验
• 3.10.1 热稳定性测定结果
• 3.10.2 酸碱稳定性测定结果
• 第4章 讨论
• 4.1 发酵条件的研究
• 4.1.1 单因素试验法
• 4.1.2 响应面优化法
• 4.2 工作展望
• 结论
• 参考文献
• 致谢