基于异位表达系统的水稻报告基因表达模式系的创建及控制水稻开花期基因RID1的功能研究

论文摘要

改变基因的表达模式是一种有效的基因功能研究策略,可以帮助研究者发现特定基因的未知功能以及时空效应。本研究采用的GAL4/UAS异位表达系统是一种成熟的改变基因表达模式的双因子系统,通过目标系与特异表达模式系的杂交,可以实现改变目的基因的时空表达谱。本室构建的基于GAL4/UAS系统的水稻Enhancer Trap系,既可以作为筛选异位表达系统模式系的原始材料,通过对其报告基因表达模式的观测,构建报告基因表达谱；又可以作为插入突变体库进行突变表型的筛选以及相应的基因功能分析。本研究所得到的模式系以及用作水稻抽穗期基因研究的rid1突变体均来源于这些Enhancer Trap系。本研究的主要结果如下：1.将吴昌银博士改造的pEGFP载体用于构建水稻Enhancer Trap突变体库,统计数据显示引入该载体后,突变体库平均分化效率为57.35%,对其中4,416份样品检测所得阳性率为91.21%,该载体用于在水稻品种中花11号中构建突变体库是可行的。2.从用pEGFP载体构建的Enhancer Trap系中选取4,416个单株,单独移栽并进行PCR阳性检测,然后对其中的阳性单株进行全生育期不同部位（不含根）报告基因表达观测,构建了T0代报告基因表达谱,T0代报告基因表达频率约为60%。3.从T0代特异表达家系中,选取了140份特异表达材料进行T1代全生育期水培,观测不同时期不同部位（包含根）GFP表达情况。观测结果显示T1报告基因表达情况相对于T0代出现丢失现象,而且不同部位丢失比例不一样。4.T0代及T1代所得的特异表达材料,经过多次复筛及选择,得到了一批模式系候选材料,通过对这些候选材料的进一步复筛得到了45个特异表达模式系,这些家系的GFP表达部位涵盖了水稻的主要器官。5.对来自45个特异表达模式系的143个株系进行了T-DNA插入拷贝数检测,检测结果显示虽然所得的特异表达模式中报告基因的表达模式特异并稳定遗传,但是没有出现明显的拷贝数分离现象,大多数株系仍然存在多拷贝,没有按照预期分离出大量单拷贝。6.筛选所得的部分特异表达模式系材料,与目标系植株（携带UAS控制下的GUS报告基因和目标基因的pGOC17载体转化水稻品种中花11号）进行杂交,对杂交后代的报告基因表达观测显示,本研究所的模式系可以成功应用于GAL4/UAS异位表达系统。7.从所得的特异表达模式系中,选取了6个在花器官特异表达的家系,进行幼穗发育过程的GFP表达观测。观测结果显示,在不同模式系的穗发育过程中,GFP报告基因表现出不同的表达模式,说明了被标记基因在水稻穗发育过程中的呈现不同的表达谱。8.针对68个家系的表达谱材料,分离了106条T-DNA插入位点左、右端的侧翼序列,并对这些侧翼序列进行了分析,从中获得13个与报告基因表达模式一致的基因序列。9.从构建模式系的材料中,选取了578个家系观测其正常田间种植条件下突变表型,从中筛选得到了177份有明显突变表型的材料,并找到了31个报告基因表达与突变性状相关的家系。10.对水稻“不抽穗”突变体rid1进行了详尽的表型描述。在正常植株抽穗成熟以后,rid1突变体继续保持营养生长状态,甚至到了播种后600 d还是无法抽穗。叶片数统计结果显示在长、短日照条件下,野生型植抽穗以后,突变体植株在观测期间平均每10 d产生1片新的叶片。rid1突变体可以拔节,节数也比野生型植株多,但是电镜观测结果显示其SAM一直处于营养生长状态,无法向生殖生长状态转换。rid1突变体的“不抽穗”突变性状与SAM由营养生长向生殖生长的转换受阻直接相关。11.65%以上的rid1互补阳性植株可以恢复抽穗表型,但是它们的抽穗期存在极大的差异,单株间差异甚至达到了111d。推测原因是由于互补片段插入水稻基因组中的位置不同,导致RID1基因的表达模式发生了改变,从而引起了抽穗期的改变。12. RID1::RID1:GFP材料报告基因表达观测结果显示RID1:GFP蛋白在幼叶及SAM中存在,而前期数据显示RID1 mRNA仅存在于幼叶中,结合已发表的文献推测原因为该基因表达量太低导致不同检测手段出现不同结果,需要进一步的实验来加以验证。13.通过杂交方式将rid1突变引入3个典型的籼稻和3个典型粳稻品种后,6个组合的杂交后代中都出现了“不抽穗”的突变性状,F2代植株有表型的分离,说明RID1基因在籼稻和粳稻品种中都起到了重要作用。14.超表达Hd3a和RFT1 （FTL3）的结果显示,单独超量表达Hd3a或者RFT1均可以使rid1突变体恢复抽穗表型并且表现出极早抽穗的现象,说明RID1基因的突变抑制了Hd3a和RFT1的表达与积累。

论文目录

• 缩写名词表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物功能基因组学研究概述
• 1.2 植物功能基因组研究的主要策略
• 1.2.1 基于序列的基因功能研究
• 1.2.2 基于芯片技术的基因功能分析
• 1.2.3 基于功能丧失型突变的基因功能研究
• 1.2.4 基于改变表达模式的基因功能研究
• 1.3 报告基因和Gene Traps
• 1.3.1 报告基因及其种类
• 1.3.1.1 氯霉素乙酰基转移酶基因
• 1.3.1.2 β-半乳糖苷酶基因
• 1.3.1.3 β-葡萄糖苷酸酶基因
• 1.3.1.4 分泌性碱性磷酸酶基因
• 1.3.1.5 荧光素酶基因
• 1.3.1.6 绿色荧光蛋白基因
• 1.3.1.7 荧光蛋白家族报告基因的特殊应用
• 1.3.2 报告基因应用于Gene Traps系统
• 1.3.2.1 Gene Traps系统
• 1.3.2.2 Gene Traps系统中的报告基因
• 1.4 表达谱技术
• 1.4.1 基于芯片技术的表达谱
• 1.4.2 基于新一代测序技术的表达谱
• 1.4.3 报告基因表达谱
• 1.5 基于双因子反式激活元件的异位表达系统
• 1.5.1 植物中常用的双因子反式激活元件
• 1.5.2 GAL4/UAS元件在植物功能基因组学中的应用
• 1.5.3 基于GAL4/UAS系统的报告基因表达模式系的构建
• 1.6 植物开花期基因研究进展
• 1.6.1 拟南芥开花调控途径研究进展
• 1.6.1.1 光周期途径（Photoperiod）
• 1.6.1.2 春化作用（vernalization）
• 1.6.1.3 自主开花途径（Autonomous Pathway）
• 1.6.1.4 赤霉素途径（Gibberellin Pathway）
• 1.6.1.5 拟南芥开花调控途径的整合基因
• 1.6.2 成花素（Florigen）的研究
• 1.6.3 水稻抽穗期基因的研究
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料及菌株材料
• 3.1.2 实验中用到的主要骨架载体
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 本研究相关载体的构建
• 3.2.2 水稻材料的遗传转化
• 3.2.3 水稻材料的种植
• 3.2.3.1 田间种植
• 3.2.3.2 营养液培植
• 3.2.3.3 温室种植
• 3.2.4 转基因植株DNA抽取及阳性检测
• 3.2.5 转基因材料活体GFP表达观测
• 3.3.6 转基因材料切片及GFP表达观测
• 3.3.6.1 石蜡切片及GFP表达观测
• 3.3.6.2 徒手切片及GFP表达观测
• 3.2.7 转基因材料T-DNA插入拷贝数的检测
• 3.2.8 T-DNA插入位点侧翼序列的分离
• 3.2.9 水稻的杂交
• 3.2.10 GUS报告基因表达检测
• 3.2.11 SAM电镜观测
• 4 结果与分析
• 4.1 水稻Enhancer trap系材料的获得
• 4.2 构建报告基因表达谱材料的选择及阳性检测
• 4.3 报告基因表达谱的构建
• 0代报告基因表达观测'>4.3.1 T₀代报告基因表达观测
• 1代报告基因表达复筛'>4.3.2 模式系材料T₁代报告基因表达复筛
• 4.3.3 特异表达模式系的获得
• 4.3.4 模式系T-DNA插入拷贝数的检测
• 4.4 GUS目标系的获得及异位表达系统的验证
• 4.5 利用模式系监测组织器官发育过程
• 4.6 模式系侧翼序列的分离及分析
• 4.7 构建模式系材料突变表型的筛选
• 4.8 控制水稻开花期基因RID1的功能研究
• 4.8.1 rid1迟抽穗突变体的获得及表型描述
• 4.8.2 rid1迟抽穗突变体的互补验证
• 4.8.3 RID1基因表达部位检测
• 4.8.4 RID1基因在其他品种水稻品种中也起重要作用
• 4.8.5 几个水稻开花期相关基因的遗传转化
• 5 讨论及展望
• 5.1 Enhancer Trap系中的GAL4/UAS系统的一些问题
• 5.2 模式系的特异性
• 5.3 报告基因的选择与观测
• 5.4 模式系和目标系的构建
• 5.5 特异表达模式系的应用
• 5.6 基于特异表达模式系的异位表达系统的应用
• 5.7 水稻抽穗调控途径的研究
• 5.8 RID1基因作用机理的探讨
• 5.9 RID1基因的进一步研究设想
• 附录1:部分试验的详细步骤及试剂配方
• 附录2:拷贝数及田间编号信息
• 参考文献
• 作者简历
• 致谢