高产脂肪酶菌种选育与脂肪酶催化合成生物柴油

论文摘要

本研究筛选了高产脂肪酶的菌种，并探讨其应用，意在提高酶的使用次数，降低其成本，并探索该酶在转化菜油时的催化特性。研究内容和结果如下：1．从被油污染的土壤中分离微生物，通过油脂同化平板筛选产胞外脂肪酶菌株；诱变育种获得的部分菌株的发酵能力比原始出发菌株提高十倍以上；按照微生物分类学方法菌株被初步鉴定为假丝酵母、芽孢杆菌、米曲霉、假单孢杆菌。2．对于上述四个高产脂肪酶的菌种的培养条件进行优化；将正常生长的菌种约十万株接种到50mL培养基中发酵一天（45℃），二十次试验中七次的发酵能力都高于10.8IU／mL（相当于国内文献报道数据11.4IU／mL的95％）；其中5次的发酵能力超过国内文献报道数据的5％。3．对高产脂肪酶的菌种进行了分子生物学研究，测得其序列，证明为新发现菌种。4．通过盐析与层析等方法纯化发酵液中的脂肪酶。对于假丝酵母所产脂肪酶，凝胶材料HNO-E最合适；芽孢杆菌所产脂肪酶，凝胶材料HNO-E、HNO-A、HNO-B的分离效能比较好；米曲霉菌所产脂肪酶，HNO-A的分离效能最强；假单孢杆菌所产脂肪酶，凝胶材料HNO-E的分离效能最强。5．探索合适的脂肪酶载体，并通过数学模型阐述了多种蛋白对于载体的吸附位点的竞争机制；得到的固定化脂肪酶易于在固定床和流化床反应器中使用，性能接近脂肪酶LipozymeIM。6．对于各种微生物所产脂肪酶，固定化最合适的条件是：每克载体的给酶量为500U；温度为30℃；pH8.0；固定化时间为120min，载体是硅藻土。7．应用发酵生产的脂肪酶将菜籽油转化成了生物柴油；最佳条件为：油／甲醇的摩尔比为1／3、反应温度为40～50℃、固定化酶用量5％（wt）。分段添加甲醇进行反应利于保持固定化脂肪酶的活力；油脂组成影响反应转化率；来自假丝酵母等的脂肪酶对于油酸具有一定的底物特异性，原料中各脂肪酸酰基被转化（与醇氧基结合）的先后顺序为C12：0、C14：0＞C16：0、C18：0＞C18：1＞C18：2、C18：3。分析了液体发酵产脂肪酶进程与催化进程的联系；有机相酯交换催化酶活和水相水解酶活相关性不高，酯交换酶活与水解酶活出现高峰时间不一致，原因是测定脂肪酶的反应条件及反应动力学不相同；液体发酵产脂肪酶进程中水解酶活高峰的出现先于催化酯交换酶活高峰12h。本研究取得如下创新：1．筛选得到了高产脂肪酶的四个菌株，并且优化了微生物的培养条件。2．对高产脂肪酶的菌种进行了基因序列分析，证明为新发现菌种3．证明了发酵脂肪酶适合转化油酸含量中等的菜籽油成为生物柴油；并且获得了良好的生产效果。4．通过数学模型阐述了多种蛋白对于载体的吸附位点的竞争机制；对催化反应动力学方程进行了推导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 高产脂肪酶菌种的研究
• 1.1.2 微生物脂肪酶的纯化与固定化
• 1.1.3 脂肪酶催化制生物柴油
• 1.2 立题背景和研究内容
• 第二章 高产脂肪酶微生物的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 对高产脂肪酶的微生物的筛选
• 2.2.1 对假丝酵母的筛选
• 2.2.2 对芽孢杆菌的筛选
• 2.2.3 对米曲霉的筛选
• 2.2.4 对假单孢杆菌的筛选
• 2.3 对微生物的发酵条件研究
• 2.3.1 对假丝酵母发酵条件的研究
• 2.3.2 对芽孢杆菌发酵条件的研究
• 2.3.3 对米曲霉发酵条件的研究
• 2.3.4 对假单孢杆菌发酵条件的研究
• 2.4 理论分析
• 2.4.1 理论分析对应的试验现象
• 2.4.2 理论分析的数学模型
• 2.5 本章结论
• 第三章 高产脂肪酶菌株的分子生物学研究
• 3.1 仪器与设备
• 3.2 试验方法与结论
• 3.2.1 总RNA提取
• 3.2.2 PCR扩增
• 3.2.3 菌落PCR
• 3.2.4 碱法小量制备质粒
• 3.2.5 反转录
• 3.3 试验所得四个序列的对比
• 3.4 与已知序列的对比
• 3.5 本章结论
• 第四章 脂肪酶的纯化、固定化
• 4.1 假丝酵母所产脂肪酶的纯化、固定化
• 4.1.1 假丝酵母所产脂肪酶的纯化
• 4.1.2 假丝酵母脂肪酶所产的固定化
• 4.2 芽孢杆菌所产脂肪酶的纯化、固定化
• 4.2.1 芽孢杆菌所产脂肪酶的纯化
• 4.2.2 芽孢杆菌所产脂肪酶的固定化
• 4.3 米曲霉所产脂肪酶的纯化、固定化
• 4.3.1 米曲霉所产脂肪酶的纯化
• 4.3.2 米曲霉所产脂肪酶的固定化
• 4.4 假单孢杆菌所产脂肪酶的纯化、固定化
• 4.4.1 假单孢杆菌脂肪酶的纯化
• 4.4.2 假单孢杆菌脂肪酶的固定化
• 4.5 理论分析与本章结论
• 4.5.1 占据倾向固定不变的竞争吸附理论的数学模型
• 4.5.2 占据倾向可以改变的竞争吸附理论的数学模型
• 4.5.3 竞争吸附理论的一般性数学模型
• 4.5.4 本章结论
• 第五章 微生物脂肪酶催化菜籽油制生物柴油
• 5.1 假丝酵母所产脂肪酶催化菜籽油制生物柴油
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.3 试验结果与讨论
• 5.2 芽孢杆菌所产脂肪酶催化菜籽油制生物柴油
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试验方法
• 5.2.3 试验结果与讨论
• 5.3 米曲霉所产脂肪酶催化菜籽油制生物柴油
• 5.3.1 试验材料
• 5.3.2 试验方法
• 5.3.3 试验结果与讨论
• 5.4 假单孢杆菌所产脂肪酶催化菜籽油制生物柴油
• 5.4.1 试验材料
• 5.4.2 试验方法
• 5.4.3 试验结果与讨论
• 5.5 理论分析与本章结论
• 5.5.1 反应机理的探讨
• 5.5.2 流动体系中的一般性的反应动力学方程
• 5.5.3 流动体系中的谐振原理与数理方程
• 5.5.4 本章结论
• 第六章 结论
• 6.1 微生物筛选的结论
• 6.2 脂肪酶的纯化、固定化的结论
• 6.3 数学模型的结论
• 6.4 脂肪酶催化合成生物柴油的结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 附图